HIV 廣譜中和抗體研究進展

李 哲,王 衛

(北京協和醫學院比較醫學中心,中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室,衛健委人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染導致細胞免疫功能缺陷,繼發嚴重感染或腫瘤并致命,被稱之為艾滋病(acquired imunodeficiency syndrome, AIDS)。 根據 2020 年聯合國艾滋病規劃署公布數據,截止2019 年底,全球HIV 感染者 3800 萬人,新感染 HIV 170 萬人,因AIDS 死亡69 萬人[1]。 在過去一段時間,科研人員從HIV“精英控制者”體內分離出能中和多種遺傳差異 HIV 病毒株的廣譜中和抗體( broadly neutralizing antibodies, bNAbs)。 基于動物實驗和臨床研究數據,bNAbs 不僅可阻斷HIV 病毒復制,還有助于清除感染細胞及增強機體免疫反應,成為HIV 疫苗研究一個關鍵而重要的方向。

1 bNAbs 的分離及鑒定

1.1 bNAbs 的分離

根據中和活性和分離時間,可將bNAbs 大致分為兩代。 第一代bNAbs 在20 世紀90 年代分離,具有有限的中和能力;自2009 年以來,科研人員分離出中和活性更高的廣譜中和抗體,被稱為第二代廣譜中和抗體。

1.1.1 第一代廣譜中和抗體

1994 年,Burton 等[2]使用噬菌體展示技術,從HIV-1 B 亞型患者體內分離識別gp120 CD4bs 的廣譜中和抗體 b12。 1994 年,Buchacher 等[3]將 HIV感染者PBMC 與雜交瘤細胞CB-F7 電融合后獲得識 別 gp120 聚 糖 (2G12)、 gp41 MPER (2F5、4E10)[4-5]的 bNAbs。 盡管第一代 bNAbs 在動物模型上取得不錯的結果,但臨床試驗顯示這些bNAbs并不能有效抑制人體內的HIV-1 病毒[6]。

1.1.2 第二代廣譜中和抗體

利用特異性單個B 細胞分選技術、B 細胞受體測序技術、及高通量中和抗體檢測等新技術,新一代高效廣譜bNAbs 陸續被分離,且有更顯著的中和寬度[7]。 科研人員利用B 細胞分選、高通量篩選以及微量中和實驗從A 亞型HIV 病毒感染者PBMC中獲得針對V1/V2 區且中和廣度不同的兩個抗體PG9 和 PG16[8]。 其 他 bNAbs 如 CH01-CH04[9]、PGT141-PGT145[10]、CAP256-VRC26.01-12[11]也用類似的方法獲得。 后來Sok 等[12]使用重組HIV包膜三聚體BG505 SOSIP.664 gp140 作為釣餌蛋白分離慢性感染者PBMC,發現新的廣譜中和抗體PGDM1400-1412。

1.2 bNAbs 的中和作用

bNAbs 直接與Env 三聚體結合,阻斷Env-CD4受體結合或病毒與宿主細胞融合。 根據抗原-抗體復合物的序列定位和結構分析,已確定bNAbs 7 個中和位點:(1)針對包膜蛋白Env 三聚體的第一及第二可變區(V1/V2 variable domain)(如抗體PG9,PGT145);(2)針對第三可變區(V3 variable domain)(如抗體PGT121,10-1074);(3)針對CD4bs(如抗體VRC01,N6,3BNC117);(4)針對 gp120/gp41 的交界區域(如抗體35O22,8ANC195);(5)針對融合肽(如抗體VRC34.01,ACS202);(6)針對 gp120 的“沉默”面(如抗體VRC-PG05,SF12);(7)針對gp41上近膜側外部區(MPER)(如抗體10E8)。

1.2.1 針對V1/V2 的bNAbs

Env 蛋白V1/V2 區被聚糖和可變環所掩蓋[13],結構分析顯示針對 V1/V2 區的特異性抗體,如PG9、PG16、CH01-04、PGT141-145,PGDM1400-1412,和 CAP256 - VRC26.01 - 33, 利用 CDRH3(complementarity-determining region 3 loops of heavy chain, CDRH3)穿透聚糖屏障,與 V1/V2、N156/N160 聚糖形成的四元表位相互作用[8-12]。 對類似于PGT141-145 的重輕鏈序列進行富集,克隆獲得13 個 PGT145 抗體變異體,命名為 PGDM1400-1412,其中 PGDM1400 中和寬度為 83%,IC50為0.003 μg/mL[12]。

1.2.2 針對V3 的bNAbs

針對 V3 區的 bNAbs,如 PGT121、PGT128 抗體,通過不同角度突出環與V3 區聚糖作用[10,14]。 10-1074 對B 亞型病毒的中和寬度為67%,IC50為0.1 μg/mL[14]。

1.2.3 針對CD4bs 的bNAbs

細胞表面CD4 受體是Env gp120 的主要結合靶點,gp120 上與CD4 結合的區域被稱為CD4 結合部位(CD4-binding site, CD4bs)。 在 HIV-1 感染中,CD4bs 在序列和結構上表現出良好的異質性,已誘導出數量最多的 bNAbs[15]。 CD4bs 抗體包括VRC01、VRC07、N6、3BNC117、N49P 可中和 90%以上的HIV-1 毒株[16-19]。 但很多毒株已對這類抗體產生抗性,必須克服這種耐藥性才能獲得最佳的臨床效果[20]。

1.2.4 針對MPER 的bNAbs

2012 年,Huang 等[21]分離出 MPER 特異性抗體10E8,識別 MPER 區 C 端螺旋結構,中和寬度為98%,IC50值為 0.352 mg/mL。 有研 究證明 針對MPER 的免疫原刺激幼稚B 細胞可產生4E10、10E8樣抗體[22]。 因此,該抗體及相關的疫苗接種策略一直是研究熱點。

1.2.5 針對gp120/gp41 交界區的bNAbs

針對 gp120/gp41 交界區的 35O22 是 Huang等[23]人于2014 年分離得到,中和寬度為62%,IC50值為0.033 mg/mL,是迄今為止針對gp120/gp41 交界區最有效力的bNAbs。

1.2.6 針對融合肽的bNAbs

gp41 亞基 N 端有15~20 個疏水殘基,稱為融合肽,是bNAbs 特異性識別的表位,融合肽序列具有高度保守性和特異性[24]。 VRC34.01、PGT151、ACS202 可以從不同的角度結合融合肽,并在融合肽多種構象中發揮作用。 ACS202 的CDRH3 與融合肽形成的“β 鏈”相互作用,并識別gp120 N88 位保守的N-連接聚糖,中和寬度為45%[25]。

1.2.7 針對gp120 的“沉默”面的bNAbs

“沉默面”不受聚糖改變的影響,可保持對抗體識別和中和的敏感性。 VRC-PG05 是迄今為止唯一從患者體內分離的與gp120 結合的抗體,中和寬度27%,IC50值為 0.8 μg/mL。 此外由 VRC-PG05 與gp120 復合物結合片段的共晶體結構可看出,沉默面中心表位主要由N262、N295 和N448 位聚糖組成[26]。

1.3 bNAbs 的分子特點

bNAbs 具有許多共同的分子特征,首先,bNAbs要獲得中和廣度,需要發生多次體細胞高頻突變(somatic hypermutation, SHM);其次,bNAbs 通常有較長的CDR3Hs[10,27],擁有更長的CDR3Hs 通常被認為與穿透Env 蛋白糖鏈屏障的能力有關[28-29];最后,HIV bNAbs 通常具有多反應性/自身反應性,多反應性抗體一個結合位點能夠與HIV-gp140 高親和力結合,此外還存在其他結合位點與病毒表面其他配體低親和力結合。 能夠結合不同種類的抗原,即為多反應性。 多反應性抗體通過異源配體結合或雜合作用增加其對病毒的整體表觀親和力[30]。

但bNAbs 也有各自的特點。 針對V1/V2 區的bNAbs 有24~32 個氨基酸組成的CDR3Hs[31],這與穿透V1/V2 區糖基屏障有關[32]。 這類抗體 VH突變頻率為 11% ~ 18%,VK/VL突變頻率為 9% ~16%[9]。 針對 V3 區的 bNAbs 有 18~24 個氨基酸組成的中等長度CDRH3,VH突變頻率為15%~23%,VK/VL突變頻率為9%~24%,突變通常涉及堿基的插入或刪除[10]。 CD4bs 抗體表現出高親和力成熟,VH和VK基因突變頻率分別為32%和20%[33]。 針對MPER 區的bNAbs 有17~22 個氨基酸組成的中等長度CDRH3s,具有中高度的親和力,VH突變頻率為13%~21%,VK/VL突變頻率為6%~14%[33]。針對gp120/gp41 交界區的抗體種系基因為IGHV-1-18*02-和IGLV-2-14*02,VH、VL突變頻率分別為35%、24%,35O22 具有 14 個氨基酸長度的CDRH3[23],這類抗體的誘導需用與Env 結構相似的免疫原。 針對融合肽的ACS202 具有22 個氨基酸長度的 CDRH3, 盡管 VRC34.01 與 ACS202 和PGT151 有相同的IgHJ 種系基因J6*02,有由13 個氨基酸組成的相對較短的CDRH3[25]。 VRC-PG05重鏈和輕鏈種系基因為IGHV3-7*01和IGKV4-1*01,其體細胞超突變的頻率分別為9%、6%[26],SF12 的 VH、VK突變頻率分別為 17%~25%、15%~21%[34]。 其他第二代廣譜中和抗體性質信息見表1。

2 bNAbs 產生機制

深入探討促進或抑制bNAbs 進化的機制,可對HIV 疫苗的設計開發帶來啟示。 在自然感染期間,bNAbs 有兩種不同的進化機制。

2.1 病毒進化驅動機制

HIV-1 毒株多樣性的產生,已被證實是誘導bNAbs 進化的重要因素。 例如,bNAbs VRC26,針對于V1/V2 區N160 糖基表位的中和抗體,研究發現VRC26 抗體的譜系是由帶有N160 聚糖的SI 病毒(superinfecting virus, SI) 所 誘 導[11], T/F 病 毒(transmitted-Founder virus, T/F)因無 N160 聚糖而無誘導抗體產生的能力。 而后SI 病毒和T/F 病毒重組促進env多樣性增高,刺激該類抗體繼續發生體細胞高頻突變,產生廣譜中和抗體。

2.2 譜系協同進化機制

T/F Env 與B 細胞未突變共同前體(unmutated common ancestor, UCA)結合誘導自體中和抗體。受抗體中和作用影響,病毒變異發生免疫逃逸,協同譜系選擇對bNAbs 譜系更為敏感的逃逸突變體,從而為bNAbs B 細胞前體和親和力成熟提供持續刺激[40]。 因此,通過分析病毒-抗體協同進化過程,利用不同Env 三聚體免疫bNAbs 中間體促進抗體親和力成熟,就可能產生廣譜中和抗體。

2.3 其他影響因素的作用

除上述兩種機制外,還有其他因素影響bNAbs進化。 宿主因素(種族、HLA 亞型、性別、年齡、傳輸),抗原特異性因素(病毒載量、抗原暴露時間、env多樣性),免疫環境(免疫細胞、抗體效應功能、免疫球蛋白亞型)等因素都可能會影響bNAbs 的產生[41]。

續表1

3 基于bNAbs 的HIV 疫苗設計策略

3.1 聚焦保守表位的設計策略

由于部分中和抗體(antibodies that neutralize only a narrow range of viruses, nNAbs)和 bNAbs 靶向病毒包膜糖蛋白Env 相同區域,nNAbs 表位暴露可能會阻礙抗原與具有廣譜中和潛力B 細胞的結合[42],阻礙bNAb 的誘導。 因此驅動抗體識別Env保守表位的一種方法是阻礙nNAbs 表位的暴露。另一種方法是將抗體應答集中在Env 保守表位,例如CD4bs,需要優化的免疫原方案包括選擇性去除聚糖,篩選單克隆抗體,然后再逐步恢復去除的聚糖,從而誘導抗體的寬度[43]。

3.2 序貫免疫設計策略

為了克服HIV-1 病毒多樣性的問題,可能需要不同的Env 抗原來引導體液反應朝著高中和廣度方向發展。 基于HIV A、B 和C 進化支序列設計的SOSIP 三聚體分別以單獨、組合雞尾酒療法以及依次順序形式給予家兔[44],結果表明,不同Env 三聚體依次順序誘導的情況下,中和抗體反應得到促進。 克服HIV-1 多樣性的另一種方法是使用鑲嵌抗原[43],通過設計針對Env 三聚體多個靶點的嵌合免疫原,引發機體免疫反應,以解決HIV 病毒遺傳多樣性的問題。

3.3 模仿自然感染的設計策略

HIV-1 T/F 病毒與HIV-1 bNAb 共進化的研究表明,中和寬度的發展依賴于病毒env多樣性的增加[11]。 極少數慢性HIV-1 感染者會產生針對大多數病毒亞型廣譜和強效的中和抗體,這證明人類B細胞譜系可以克服HIV-1 病毒極端多樣性的問題。通過研究“精英中和者”體內病毒抗體共進化、bNAb的產生機制,尋找誘導產生bNAbs 的免疫原,可促進HIV 疫苗的研發進展。 由此概括出B 細胞譜系疫苗設計策略為:利用特異性B 細胞分選技術將bNAbs 和 bNAbs 前體分離,根據 bNAbs 和 bNAbs 前體序列推斷 bNAbs 中間體序列(intermediate antibodies, IA)、UCA 序列,并設計出 IA、UCA 免疫原。

3.4 靶向bNAb B 細胞前體的設計策略

HIV-1 Env 和基于Env 設計的免疫原通常不會與bNAbs 的推斷種系前體相互作用,這可能是Env和基于Env 設計的免疫原無法有效誘導bNAbs 原因[45]。 “種系靶向”策略旨在激活表達未突變前體B 細胞,然后進一步免疫引導bNAb 成熟[43]。 由于CD4bs 在HIV-1 毒株中相對保守,成為種系靶向疫苗研究的熱點。 此外,也開發出胚系免疫原,以誘導bNAbs 靶向Env 不同表位[43]。

4 總結

近來,抗體分離技術的進步促使大量bNAbs 被發現,隨后科研人員對于bNAbs 的功能特性進行了諸多研究,但控制bNAbs 進化產生的關鍵因素仍然未知,無法通過疫苗接種獲得bNAbs,限制了HIV疫苗研發。 目前無用于HIV bNAbs 研究的小動物模型,SHIV 感染恒河猴是HIV 相關研究的理想模型。 但此模型在研究bNAbs 反應生成機制存在一些缺陷:實驗周期長,體液免疫反應不確定等。 因此,為深入研究bNAbs 進化生成機制,探索影響bNAbs 發生發展過程的關鍵因素,必須建立 HIV bNAbs 發生發展研究平臺,特別是動物模型平臺。因此,繼續開發和完善動物疾病模型對于開發預防HIV 感染的有效疫苗同樣至關重要。