質譜技術在黃曲霉毒素檢測中的研究進展

葉 萍 張慧娥 李 光 陳長寶 王恩鵬

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)存在于天然污染的食物中，能抵抗熱降解[1]，是具有遺傳毒性、致突變性和免疫毒性的真菌毒素。不良的儲存條件、加工過程很有可能會引入AFT，并導致花生、面粉、香料和堅果等食品污染。而攝入這些被污染的食品會導致各種疾病，如癌癥、出生缺陷、消化系統紊亂、生殖功能障礙和免疫抑制[2]。在發展中國家以及濕熱地區，肝癌的發病率與AFT的污染密切相關。AFT有很好的耐熱性，需加熱至280～300 ℃才能被分解，因此，在正常的食品加工過程中，這些毒素很難被去除掉。此外，修飾或掩蔽性的霉菌毒素(通常以與糖等極性物質共軛的方式存在，進而轉化為極性更強的結合態代謝產物)的毒性可能與原霉菌毒素相同，甚至更高[3]。

目前，常用的AFT分析方法有高效液相色譜法(HPLC)[4]、酶聯免疫吸附法(ELISA)[5]、熒光光譜法[6]、薄層色譜法(TLC)[7]等，雖然這些方法均被廣泛應用，但普遍存在各種問題。例如ELISA的檢測范圍較窄，熒光分光光度法的回收率、精密度以及檢測范圍較小[8]，且變異系數較大；而便宜且方便的TLC技術的主要目的是定性，并不能夠精確定量。為了更加準確、快速和高通量地檢測食品中AFT含量是否超標，質譜技術作為一種獨特的定性、定量及分離待測物的有力工具而逐漸被大量采用，其特點是檢測限較低，線性關系好，與其他方法可相互兼容，能用于日常生活中的不同食品基質及環境土壤中AFT的檢測。文章擬對質譜技術檢測AFT的方法進行綜述，為進一步開發有關質譜的AFT的分析研究方法提供依據。

1 黃曲霉毒素的主要類型

1.1 黃曲霉毒素B類

AFT(圖1)為二氫呋喃香豆素的衍生物，極性小，形成無色至淡黃色的晶體，這些晶體如果大量存在，則會在紫外光下呈強烈的熒光，發出藍光的為AFB類化合物，其中AFB1是AF家族的標志性真菌毒素，毒性最強，其肝臟毒性和遺傳毒性已在動物研究中被證實[9]，AFB1及其代謝物可通過食物鏈在肉雞肝臟中積聚，人類攝入后會引起慢性或急性肝損傷，甚至肝癌[10]。幾乎所有糧食谷物在適宜條件下均會成為此種化合物的寄生基質。流行病學證據[11-12]表明，人類接觸AFB1與包括非洲部分地區在內的許多中低收入國家的肝癌發病率之間存在密切聯系。而在中國，AFB1一直是被重點控制的對象。

1.黃曲霉毒素B1 2.黃曲霉毒素M1 3.黃曲霉毒素G1

1.2 黃曲霉毒素M類

AFM1是潛在致癌物AFB1的主要氧化衍生物，由肝臟細胞色素P450相關酶產生，主要存在于牛乳及乳制品中，其毒性和致癌性與AFB1基本相似[13-14]。AFM1可引起生鮮乳安全問題[15]，因此通常被認為是“乳毒素”[16]。巴氏消毒法無法破壞AFM1的結構，而牛乳及乳制品作為嬰幼兒的主要食物，AFM1的存在對嬰幼兒的身體健康構成了極大威脅。目前，已報道的AFM1的分析方法有ELISA法[17-18]、LC法[19]等，這些方法雖具有高度特異性和一定的選擇性等優點，但耗時、操作繁瑣和價格昂貴。質譜技術作為一種高通量、高選擇性、普適性的方法來用于準確測定AFM1是非常適合的。

1.3 黃曲霉毒素G類

AFG類主要包括AFG1和AFG2，其中AFG1是僅次于AFB1的第二大毒性AFT[20]。動物試驗[21]表明，AFG1會誘導小鼠的肺增生性病變和肺腺癌，也會導致試驗動物肝臟腫瘤的發生。文獻[22]報道了AFG1誘導的肺炎是腫瘤壞死因子(TNF)所依賴的，其增強了炎癥肺組織AT-II細胞的DNA損傷以及細胞色素P450(CYP2A13)的表達，同時可誘導與肺泡上皮細胞氧化應激相關的慢性肺部炎癥[23]。在檢測AFG類化合物時，大多數情況下可采用HPLC-FLD和HPLC-MS法。如果用FLD檢測器檢測分離的組分，則需要柱后衍生化以增強AFG1的天然熒光性質[24]。

2 黃曲霉毒素的質譜檢測分析方法

2.1 液質聯用法

近年來，液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術因其可同時監測多種真菌毒素而日益受到重視。其中液相部分從最初的常規LC，逐漸發展為超高壓液相色譜(UHPLC)[25]、二維液相色譜(2D-LC)、納升液相色譜(Nano-LC)[26]等，極大地提升了液質聯用技術的檢測效率。質譜部分可供選擇的離子源包括電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學電離源(APCI)、大氣壓光電離源(APPI)、基質輔助激光解吸/電離(MALDI)、實時直接分析質譜離子源(DART)[27]等。與離子源搭配的質量分析器包括三重四極桿分析器(QQQ)、飛行時間分析器(TOF)[28]、軌道離子阱分析器(Orbitrap)[29]、傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)[30]等。MALDI的廣泛應用主要與其電離極性分子有關，該過程幾乎完全產生單電荷離子，近10年來，該技術作為一種快速、可靠的鑒定方法得到了廣泛應用，與通過噴灑樣品溶液使分析物分子電離的ESI不同，MALDI分析的樣品需要在靶板上與過量的小分子基質(通常是可吸收紫外線的有機酸)共結晶，然后通過激光輻射產生樣品離子，其與高質量范圍的分析器TOF可以很好地結合在一起，只需一次電離就可以觀察到高分子量的生物分子。Ramos等[31]采用MALDI-TOF-MS對AFB1、B2、G1和G2進行分析，獲得了無基質質譜，并加入NaCl，通過Na+增強靈敏度，從而實現了對AFB1、B2、G1和G2的有效檢測。該技術速度快、樣品制備少，不需要衍生化或色譜分離，因此適合于AFT的高通量篩選。LC與UPLC聯用時，其中的UPLC-Q-TOF-MS[32]作為機械分離科學中的一個全新類別，借助于HPLC的色譜理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、超低系統體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。姚婷等[33]采用UPLC-Q-TOF-MS來分析發酵黑茶中AFB1的含量，與傳統的檢測方法相比，其樣品前處理過程簡單、時間短，有機溶劑用量少，且目標分析物無需衍生即可直接測定，能夠顯著提高結果的準確性。

2.2 熒光分析法結合質譜法

隨著分析技術的發展，生物分析中出現了熒光分析[34]、比色分析[35]、化學發光分析[36]、電化學分析[37]等新方法。其中，熒光分析(FLD)因其背景強度低、操作簡單、檢測靈敏度高而備受關注[38]。但由于AFT天然熒光較弱，許多方法在進行前需對樣品柱前或柱后衍生化[39]。基于質譜技術的分析方法具有較高的特異性和靈敏度，并且隨著MS儀器的廣泛使用[40]，該技術的應用變得越來越普遍，其能與LC-FLD[41-42]兼容，可用于單一或多種AFT的測定，而無需額外的樣品處理。Trucksess等[41]采用LC-FLD法結合三重四極桿質譜聯用儀，對玉米、花生和花生醬中的AFT總量和單個AFT進行測定，其回收率比單獨使用FLD法高，此種方法適用于植物來源的食品中AFT的檢測。此外，Hao等[43]基于T7核酸內切酶輔助的級聯循環擴增策略和DNA模板銀納米簇(DNA-AgNC)的方法，建立了AFB1的無標記FLD檢測新方法。即在靶標AFB1存在的情況下，通過發夾H1特異性地捕捉靶標，形成復合體H1-AFB1，這一步為復合物H1-AFB1-H2的形成創造了條件，此過程會逐步循環放大，并產生大量的序列，這些序列即AgNC的合成模板。其顯示的熒光強度與AFB1濃度呈良好的線性關系。該方法與質譜技術聯用，已被成功應用于食品樣品中AFB1的測定，檢出限可達0.89 pg/mL。其中所用到的以DNA為模板的銀納米(DNA-AgNC)作為一種新型的熒光載體受到了特別的關注，其性能優于有機染料和量子點[44]。更重要的是，作為AgNC合成模板的DNA序列可以靈活地編程到探針[45-46]中，避免了用熒光團的繁瑣和麻煩，既節省了試驗成本，又節省了人力和時間，是整個質譜檢測體系中的新步驟。

2.3 同位素稀釋質譜法

自Hevesy等[47]提出同位素稀釋法以來，已經按照這種“稀釋”原理創建了多種分析方法，在此基礎上，同位素稀釋質譜法(IDMS)已被廣泛地應用于多種有機物和無機物的測定，受到了極大的關注和發展。LC-MS未使用同位素內標，樣品前處理步驟繁瑣，目標物損失嚴重，檢出限高，回收率偏低。IDMS優化了影響試驗結果的一系列參數，能夠得到最佳的試驗條件，可用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品、嬰幼兒食品中AFB族和G族的測定[48]。羅蘭等[49]使用同位素內標，并采用UPLC-MS的方法來檢測嬰兒輔食中AFM1含量，得到的檢出限為0.01 μg/kg，RSD值均<4%。魏敏等[50]用液相色譜—同位素稀釋質譜法來測定嬰幼兒配方奶粉中AFM1基體標準物質研制的定值，其檢出限為0.01 μg/kg，定量限為0.05 μg/kg。Henrion[51]提出了精確匹配雙同位素稀釋質譜(EMD-IDMS)的概念。EMD-IDMS是一種通過有效地消除儀器分析步驟中的偏差，并通過直接連續多次測量兩種混合物來減少不確定度的方法。通過尖峰加強要分析的物質，以便產生樣品混合物和校準混合物，標準物質的數量使得樣品和校準混合物中的同位素比率在雙重IDMS中“精確”匹配，在這種情況下，所有與儀器有關的偏差均變得可以忽略不計[52]。與LC-MS結合使用時，由于大氣壓電離源抑制了分析物的電離，快速分析時間和高進樣量可能會對LC-MS的信號強度產生不利影響[53-54]，但同位素比率在一定程度上不受影響[55]，這既補償了基質效應的影響，也可有效抵消基質效應和前處理的操作損失，而提高色譜分辨率也是減少基質效應的一種較好的方法，因為在離子抑制的情況下，信號強度有所提高[56]。穩定同位素稀釋法(SIDA)同樣是在IDMS的基礎上發展起來的，Zhang等[57]采用SIDA與LC-MS/MS法同時測定食品中的多種真菌毒素，樣品用乙腈/水提取，濃度為1.0～1 000.0 ng/g，回收率的RSD值<10%，整個過程不僅簡化了樣品的制備，也實現了樣品的同時鑒定和定量分析。

2.4 電感耦合等離子體質譜

2001年，Zhang等[58]提出了基于電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)檢測的免疫分析方法。隨后，ICP-MS在生物分子分析中的重要性呈指數增長[59]。與其他成熟的方法相比，ICP-MS具有譜線簡單、穩定性高、特異性強、靈敏度高、易于與多種分離技術耦合的特點。最初，分析僅限于那些含有ICP-MS能檢測到的雜原子的物種，容易受到光譜干擾，分析優值系數也會受到影響[60-61]。為了提高分析優值，以及解決不含雜原子生物分子的測定問題，生物分子可以通過與雜原子或有機金屬化合物的化學反應進行衍生化[62-63]，但這種方法的選擇性較低。目標分析物也可以通過使用雜原子標記的抗體免疫反應來標記[64-65]。由于抗原—抗體反應的高度特異性，可以在復雜的混合物中如奶制品中測定AFT。此過程使用的雜原子標記物包括過渡金屬和金屬納米顆粒等，而Pérez等[66]認為，使用金屬納米顆粒是提高分析優值(如靈敏度等)的最有利方法，并通過使用二級生物素化的抗體與鏈霉親和素結合的金屬納米顆粒的競爭性免疫反應，建立了ICP-MS對超痕量牛奶樣品中的AFM1進行檢測，在最佳條件下，該免疫分析方法的檢出限可低至0.005 μg/kg。以ICP-MS為基礎發展起來的氫化物—電感耦合等離子體質譜法(HG-ICP-MS)[67]、氣相色譜—電感耦合等離子質譜聯用(GC-ICP-MS)[68]、在線電感耦合等離子體質譜(Electrochemical On-line-ICP-MS)[69]、四極桿ICP-MS[70]、激光消融-ICP-MS(LA-ICP-MS)[71]、毛細管電泳—電感耦合等離子體質譜(CE-ICP-MS)[72]結合的方法得到了廣泛關注，可為檢測AFT技術的發展提供參考，尤其是在檢測AFM1時，由于其具有較高的健康風險和限制性的法律要求，可用半抗原模型來評估以上不同方法的優缺點。

3 應用質譜技術檢測AFT在食品中的應用

3.1 谷物

質譜技術是檢測谷物、糧食中AFT是否超標的重要步驟。郭芳芳等[73]采用LC-MS對小麥粉中的AFB1進行測定，樣品用甲醇—水提取并用免疫親和柱凈化富集，串聯質譜檢測后得到的檢測限為0.03 μg/kg，可為檢測其他食品中的真菌毒素提供參考。谷葉等[74]采用TSQ-MS檢測花生、玉米、燕麥片中的AFT，其對AFB1、B2、G1、G2的檢出限分別為0.110，0.009，0.012，0.008 μg/kg，且回收率與精密度較好，可為其在谷物和糧食檢測方面提供依據。

3.2 奶制品

奶制品中污染最大的真菌毒素主要是AFM1，通過奶牛的尿液和奶汁排出。近年來，液質聯用法用于檢測奶制品中AFT含量具有很大的應用價值，張俊等[75]采用LC-MS/MS檢測生鮮乳中AFM1含量，通過優化質譜參數以達到最大的離子強度，其回收率為80%～110%，RSD在8.4%以內，重復性良好，此種方法在檢測奶制品方面值得推廣應用。此外，Campone等[76]采用在線固相萃取-UHPLC-MS對69種牛奶樣品進行分析，以評估AFM1的發生率。結果表明，巴氏殺菌牛奶中AFM1的檢出率為72.7%，其中在線SPE清除具有高度的選擇性，能為檢測奶制品中AFT提供新方法。

3.3 調味品

醬油、食用醋等調味品生產中主要使用的是曲霉菌，一定程度上給AFT的產生提供了條件[77]，污染嚴重不僅會對人體產生嚴重的危害，也會造成巨大的經濟損失。為了檢測傳統調味品中AFT含量是否超標，楊春林等[78]將豆瓣等樣品先通過免疫親和柱凈化后再用UPLC-TSQ-MS進行檢測，通過調整信噪比，最終得到的檢出限為0.017～0.051 μg/L，提示此方法較為靈敏，能同時測定調味品中的多種AFT。除UPLC-TSQ-MS外，新型質譜聯用技術如QuEChERS萃取-UPLC-MS/MS也被廣泛應用，梁劍鋒等[79]為了測定花生醬中AFB1含量，先采用QuEChERS凈化樣品，再用UPLC-MS/MS掃描檢測，該方法檢出限較低，回收率較高，精密度好，作為檢測調味品中AFT的技術具有較大的推廣價值。

表1為AFT質譜檢測技術在食品中的應用。

表1 AFT質譜檢測技術的分類及應用

4 結語與展望

近年來，各種質譜新技術不斷涌現，已成為推動現代分析技術進步的重要支撐，其高通量、高選擇性、高靈敏度、高精密度的特性，可對復雜樣品進行實時分析等特點，使其在黃曲霉毒素檢測方面的應用越來越廣泛。將新型質譜檢測技術應用于飼料、煙草、糧食谷物及奶制品中，并擴大到其他領域，可以在最大程度上節省檢測時間，提高準確度。雖然傳統的檢測技術因特異性差、選擇性低、靈敏度差、檢測限高等缺點應用逐漸減少，但仍不失為較簡易的方法。質譜技術在黃曲霉毒素的檢測領域雖然具有較多自身優勢，但同樣存在一些如設備成本較高，對儀器操作人員要求高等缺點。因此如何能夠針對不同種類的食品基質，通過優化前處理條件，利用不同種類的質譜技術對樣品進行專門檢測將成為未來一段時間內較為熱門的話題。此外，進一步開發原位、快速、實時、操作簡單、高通量的質譜方法，并將其做到便攜化、小型化，將極大地推動質譜技術在現場食品黃曲霉毒素檢測中的廣泛應用。