南極磷蝦油亞臨界萃取工藝優化及揮發性成分分析

孫德偉 謝 強 李進偉 劉元法

(1.無錫商業職業技術學院，江蘇 無錫 214153；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫 214122；4.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

南極磷蝦油主要成分有ω-3多不飽和脂肪酸、磷脂、蝦青素、維生素E等生物活性物質[1]，其中磷脂型ω-3多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的34%[2-3]，被譽為海洋卵磷脂[4]。當前，制備南極磷蝦油主要采用溶劑提取和無溶劑提取兩類[5-6]。采用溶劑制備南極磷蝦油，通常選用丙酮、乙醇或正己烷等單一溶劑，但存在耗費時間長、效率低、溶劑殘留及原料中部分生物活性成分易失活等弊端；也有先丙酮后乙醇兩步溶劑法制備南極磷蝦油的報道[7-8]，但兩步法也存在耗時長、產物脫溶分離成本高等問題；采用超臨界CO2夾帶20%乙醇制備南極磷蝦油，但需先對南極磷蝦進行脫水干燥，干燥過程中的高溫會破壞南極磷蝦中的熱敏成分[4，8]；采用超臨界流體提取技術制備南極磷蝦油，但超臨界制備設備構造復雜、維護使用成本較高[9-10]。無溶劑提取酶法也被用于南極磷蝦油的制備[11-12]，但專用酶的價格昂貴限制了其在脂質制備中的規模化應用，且提取水環境中磷脂乳化也會降低其提取率。基于此，當前亟需一種經濟、污染小且能夠最大限度保存南極磷蝦油生物活性物質的制備方法。

亞臨界流體提取技術具有工作壓力低、工作溫度相對較低、綜合效率較高、總體投資和運行成本相對較低等優勢，在一些特種植物油[13-14]和特種動物脂的分離制備中被小規模化應用[15-16]。部分學者[17-18]研究了亞臨界萃取南極磷蝦油技術，Xie等[19]系統研究了多種溶劑分離制備南極磷蝦油，涉及到亞臨界丁烷制備南極磷蝦油，但該研究采用了亞臨界丁烷分離小麥胚芽油的條件[20]。文章擬選擇亞臨界流體提取技術提取南極磷蝦油，并對其提取工藝進行優化，旨在為南極磷蝦油綠色工業化生產提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗原料及設備

南極磷蝦粉：含水(9.0±0.5)%，-40 ℃保存備用，遼漁集團有限公司；

試驗試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

亞臨界提取裝置：BE-5L型，河南亞臨界生物技術有限公司；

高效液相色譜：1260型，配備蒸發光散射檢測器，美國安捷倫科技公司；

氣相色譜：7820A型，美國安捷倫科技公司；

旋轉蒸發儀：R205D型，無錫申科儀器廠；

離心機：5810型，德國艾門德公司；

pH計：FE28型，瑞士梅特勒—托利多公司；

分析天平：ME104E型，瑞士梅特勒—托利多公司；

磁力攪拌器：VORTEX 1型，德國IKA公司；

震蕩搖床：CHA-S型，金壇榮華儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 南極磷蝦油分離 將500 g南極磷蝦粉用布袋封口放入提取罐，抽真空。按料液比(m南極磷蝦粉∶V丁烷)1∶5(g/mL)將亞臨界溶劑丁烷泵入提取罐，外套熱水循環控制提取溫度，設定條件提取完成后將提取混合液導入分離罐減壓蒸發分離產物。多次提取后合并提取物，離心過濾稱重，并按式(1)計算南極磷蝦油提取率。

(1)

式中：

m1——單位質量原料按試驗方法制備的油的質量，g；

m0——單位質量原料按Folch方法[21]制備脂質的質量，g；

N——南極磷蝦油提取率，%。

1.2.2 響應面優化南極磷蝦油提取工藝 在前期試驗的基礎上，以提取時間、提取溫度和提取壓力為考察因素，采用Box-Behnken設計，以南極磷蝦提取率為響應值優化南極磷蝦油的亞臨界制備工藝條件。

1.2.3 南極磷蝦油揮發性成分分析 采用頂空固相微萃取和氣相色譜—質譜/質譜(HS-SPME-GC-MS)檢測南極磷蝦油揮發性成分。取南極磷蝦油10.0 g封閉于25 mL頂空瓶中，以封口膜密封。

(1)HS-SPME過程：對固相萃取柱(DVB/CAR/PDMS, 50/30 μm)進行預處理，將萃取裝置上萃取柱插入GC進樣口，270 ℃老化30 min，載氣為氦氣，流量1.0 mL/min；將萃取柱插入裝有待測樣品的頂空瓶上層，70 ℃震蕩吸附30 min，隨即將萃取柱插入GC進樣口，250 ℃解吸5 min后進行GC/MS分析。

(2)GC/MS分析：GC條件為HP-5MS毛細管柱(長30 m，內徑0.25 mm)，載氣為99.99%氮氣，流速1.0 mL/min；程序升溫為45 ℃保持2 min，以3 ℃/min升至130 ℃，10 ℃/min升至240 ℃保持8 min；MS條件為電子轟擊離子源，離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV，碎片掃描范圍32～560(m/z)。未知化合物經計算機譜圖庫NIST、WILEY檢索定性分析，根據相對峰面積定量。

1.2.4 統計學分析 采用同批次原料重復3次，使用SPSS 18.0軟件分析方差(ANOVA)，結果以平均值±標準差表示，P<0.05時具有統計學差異。

2 結果與討論

2.1 亞臨界分離南極磷蝦油工藝優化

2.1.1 響應面試驗設計及結果 選取提取時間、提取溫度和提取壓力為主要因素，以提取率為響應值，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理進行響應面法設計，試驗因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 試驗因素水平及編碼

2.1.2 模型的建立及方程分析 利用Design-Expert 7.0軟件對表2中的響應值與各因素進行多元回歸分析，得到二次多項式回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及結果

(2)

表3 回歸模型方差分析?

2.1.3 響應面分析 由圖1可知，隨著提取時間的延長，提取率呈升高趨勢，前段升高快，后期升高平緩。隨著提取溫度的上升，提取率呈先增高后稍有下降趨勢，當提取溫度為40～50 ℃時，提取率達到最高。

圖1 提取時間和提取溫度對提取率的交互作用

由圖2可知，隨著提取時間的延長，提取率總體呈升高趨勢，前段升高快，后期升高平緩。隨著提取壓力的上升，提取率呈緩慢上升趨勢。

圖2 提取時間和提取壓力對提取率的交互作用

由圖3可知，隨著提取溫度的上升，提取率呈先升高后降低趨勢。而隨著提取壓力的上升，提取率呈緩慢上升趨勢。

圖3 提取溫度和提取壓力對提取率的交互作用

2.1.4 回歸模型驗證 根據回歸模型計算得到亞臨界丁烷制備南極磷蝦油最佳工藝條件為提取時間132.74 min，提取溫度42.07 ℃，提取壓力1.08 MPa，南極磷蝦油最高提取率可達81.95%。結合實際操作，將工藝條件修正為提取時間120 min，提取溫度40 ℃，提取壓力1.0 MPa，為驗證結果的可靠性，進行3次重復試驗，測得南極磷蝦油提取率為(81.2±0.4)%，與預測值接近，說明二次回歸方程模型合理，試驗結果較理想。

響應面優化試驗條件與邢要非等[23]亞臨界丁烷制備棉籽油、劉日斌等[24]亞臨界丁烷制備芝麻油、馬燕等[25]亞臨界丁烷制備杏仁油的提取條件較為相近，且其亞臨界提取溫度略有降低，這有利于動物性原料中熱敏性成分的保護。此外，亞臨界丁烷最佳提取時間的差異可能與原料性質有關，如芝麻油和杏仁油為植物來源原料。

2.2 南極磷蝦油揮發性成分

為進一步研究亞臨界丁烷準備南極磷蝦油的性質，采用頂空固相微萃取和氣相色譜—質譜/質譜(HS-SPME-GC-MS/MS)檢測亞臨界丁烷制備的南極磷蝦油揮發性成分，其總離子流圖如圖4所示。

圖4 南極磷蝦油揮發物GC-MS總離子流圖

經NIST、Wiley2008譜庫串聯檢索，共檢出醛類、酸類、烴類等化合物，其保留時間、化合物名稱及相對峰面積見表4。

由表4可知，南極磷蝦油主要揮發性成分有27種，其中2-癸烯醛、11-烯醛、癸酸為主要成分。丁浩宸等[26-27]發現，醚類、醛類是整蝦的關鍵揮發性成分，其中頭胸部的揮發性成分主要是(E,Z)-2,6-壬二烯醛、3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛、壬醛、苯乙醛、D-檸檬烯、(Z)-4-庚烯醛、二甲基硫醚、辛醛、苯甲醛，腹部揮發性物質主要是二甲基三硫醚、癸醛、壬醛、3-甲基丁醛、辛醛、D-檸檬烯、二甲基硫醚、(Z)-4-庚烯醛。Giogios等[28]發現蝦粉和蝦油揮發性物質不同，包括蝦油在內的海洋油脂揮發性物質有較高含量的乙基呋喃、2-亞甲基丁基環丙烷、己醛、2,4-辛二烷、3,5-辛二烷；而蝦粉中揮發性物質幾乎檢測不到不飽和環烴和萜類，呋喃含量較低。而南極磷蝦油揮發性物質中也幾乎不含不飽和環烴類和萜類，其呋喃含量也較低，總體組成與文獻[26-28]基本一致，但具體含量有一定差別，可能是由于原料差異所致。綜上，南極磷蝦油中揮發性成分組成不如其脂肪酸具有穩定的組成和含量，但也能作為南極磷蝦油真偽鑒定的一個特征性指標。

表4 揮發性組分組成及相對含量

3 結論

以南極磷蝦粉為原料，采用亞臨界丁烷分離制備南極磷蝦油。結果表明，南極磷蝦油的最佳亞臨界制備工藝為提取溫度40 ℃，提取壓力1.0 MPa，提取時間120 min，此時南極磷蝦油提取率為(81.2±0.4)%。頂空固相微萃取和氣相色譜—質譜/質譜分析表明，該南極磷蝦油揮發性成分主要為2-癸烯醛、11-烯醛、癸酸等27種，通過對比發現南極磷蝦油中揮發性成分組成可以作為南極磷蝦油真偽鑒定的一個特征性指標。后續可研究南極磷蝦油的特殊性質。