牛羊乳區(qū)別檢驗(yàn)的PCR高分辨熔解檢測(cè)方法

賀曉玲，馬西亞，徐秦峰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

食品摻假是人們一直以來(lái)比較關(guān)注的問(wèn)題，乳及乳制品作為一種富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的日常消費(fèi)品，成為了非常容易受到摻假影響的食品[1]，在世界各國(guó)都存在摻假現(xiàn)象[2]。隨著人們消費(fèi)觀念的提高，高品質(zhì)、高營(yíng)養(yǎng)的水牛乳和羊乳產(chǎn)品逐漸獲得消費(fèi)者的認(rèn)可[3-4]。為謀求商業(yè)利益，不法商家用牛奶代替山羊奶或者水牛奶[5-7]，進(jìn)而引發(fā)經(jīng)濟(jì)利益、宗教習(xí)俗、過(guò)敏等問(wèn)題[8-10]。因此，亟需鑒定乳制品的乳源種類，以保護(hù)消費(fèi)者免受摻假產(chǎn)品的侵害。

目前鑒別乳源成分的方法主要為蛋白質(zhì)和DNA序列分析。相比于蛋白質(zhì)，DNA由于穩(wěn)定性高更適合作為各類乳制品檢測(cè)分析的目標(biāo)物[11]。DNA的分析方法中，PCR因其特異性好、靈敏度高而被廣泛應(yīng)用[12]。普通PCR產(chǎn)物分離通常需要結(jié)合RFPL[13]、電泳[14]、測(cè)序等開(kāi)管檢測(cè)方法，容易產(chǎn)生污染。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)PCR被引入鑒定乳制品的真?zhèn)巍?shí)時(shí)PCR包括探針?lè)ê腿玖戏╗15]，其中探針?lè)▋r(jià)格貴且設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，染料法雖然成本低、通用性好，但相對(duì)于探針?lè)ㄌ禺愋圆粡?qiáng)。高分辨熔解曲線是一種在實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增完成后監(jiān)測(cè)擴(kuò)增子熔解行為的分析方法，可以區(qū)分目標(biāo)基因序列的微小差異，具有靈敏、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)，常被應(yīng)用在基因分型、突變掃描和甲基化檢測(cè)領(lǐng)域[16-19]。近年來(lái)，PCR高分辨熔解曲線(high-resolution melting, HRM)廣泛用于肉制品、海鮮、乳制品等食品的真實(shí)性鑒定和溯源分析[19-20]。在檢測(cè)乳及乳制品摻假方面，特異性引物結(jié)合PCR-HRM方法被用于區(qū)分希臘菲達(dá)奶酪中牛、山羊、綿羊3種動(dòng)物源性成分[6]、鑒別水牛乳制品中的牛乳成分[21]。基于特異性引物的PCR-HRM方法在鑒別乳源成分時(shí)，需要進(jìn)行復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)，在進(jìn)行多重檢測(cè)時(shí)需要添加多對(duì)引物，使得反應(yīng)體系復(fù)雜、優(yōu)化困難且浪費(fèi)試劑。通用引物克服了特異性引物的不足，不需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化就能實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系中檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)物。本文將通用引物與HRM相結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)山羊、綿羊、牛、水牛4個(gè)物種的鑒別檢測(cè)，達(dá)到分析乳及乳制品中多個(gè)物種的目的，為維護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益以及乳產(chǎn)品市場(chǎng)安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

生牛乳、生羊乳，西安市未央?yún)^(qū)奶牛場(chǎng)和市場(chǎng)；生水牛乳和綿羊乳，淘寶網(wǎng)，鮮奶于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜隍?yàn)證特異性的非目標(biāo)DNA(驢、馬、兔子、雞、鴨、鴿子、魚(yú)、豬)，四川華漢三創(chuàng)有限公司。不同品牌的牛、山羊、綿羊、水牛乳產(chǎn)品(液態(tài)乳、全脂奶粉、脫脂奶粉及配方奶粉)等樣品分別購(gòu)自西安市以及網(wǎng)上不同的超市。

1.2 試劑與儀器

磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker，天根生化科技有限公司；通用引物，生工生物工程股份有限公司；EvaGreen，Biotium公司。MyGo Pro熒光定量PCR儀，IT-IS Life Science Ltd；MYSPIN 12微型離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific；5424R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf 有限公司；Q6000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Quawell。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取DNA

將購(gòu)買的液態(tài)乳和固體乳粉的脂肪去除后，按照磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒操作步驟，提取所有樣品的DNA。采用超微量核酸定量?jī)x測(cè)定DNA的濃度和純度，將DNA稀釋至20 ng/μL，放于-4 ℃冰箱備用。

2.2 設(shè)計(jì)通用引物

根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)所公布的GU295658(山羊)、AF010406(綿羊)、AF492351(奶牛)和NC_006295(水牛)的基因序列，通過(guò)BioEdit對(duì)比其核苷酸全序列，依據(jù)物種的保守性和特異性，按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，保證通用引物可同時(shí)特異性擴(kuò)增4個(gè)物種，且擴(kuò)增產(chǎn)物間的序列具有差異性，能夠通過(guò)高分辨率熔解曲線分析鑒別。

2.3 PCR-HRM反應(yīng)體系建立

PCR反應(yīng)體系組成為：5 μL 2×Tap PCR Master Mix，1 μL(20 ng/μL)DNA模板，0.5 μL的上游引物和下游引物，0.5 μL 20×EvaGreen染料，最后加水補(bǔ)充至10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，擴(kuò)增完成后立即對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨熔解程序：65～95 ℃升溫熔解，熔解梯度為0.05 ℃/s。在該溫度范圍熔解，既可以去除引物二聚體的干擾，也可以保證得到足夠有效的熔解數(shù)據(jù)進(jìn)行HRM分析。擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)驗(yàn)證片段大小。

2.4 PCR-HRM可行性和特異性驗(yàn)證

將通用引物擴(kuò)增的目標(biāo)序列導(dǎo)入BioEdit對(duì)比4個(gè)物種的基因序列差異性，確認(rèn)DNA序列具有可區(qū)分性。進(jìn)一步將4條目標(biāo)序列導(dǎo)入u-melt線上軟件擬合高分辨熔解曲線，分析是否可以相互區(qū)分。將從牛、水牛、綿羊、山羊乳及其制品中提取的DNA作為模板，進(jìn)行PCR-高分辨熔解實(shí)驗(yàn)，對(duì)比擬合曲線與實(shí)驗(yàn)所得曲線，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的可行性。將購(gòu)買的雞、豬、馬、兔和魚(yú)等動(dòng)物的DNA稀釋至20 ng/μL分別加入PCR-HRM反應(yīng)體系，觀察有無(wú)擴(kuò)增曲線，取擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)通用引物的通用性及特異性。

2.5 PCR-HRM體系檢測(cè)多元混合物

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建立的方法的區(qū)分能力，將山羊、綿羊、牛、水牛4個(gè)物種的DNA按照排列組合方式預(yù)先混合，其中單組分4種、雙組分6種、3組分4種和4組分1種共計(jì)15種混合物，對(duì)所有DNA混合物執(zhí)行相同的PCR-HRM實(shí)驗(yàn)程序，考察該檢測(cè)方法對(duì)混合物的區(qū)分能力。

2.6 PCR-HRM體系檢測(cè)不同摻假比例樣品

取20 ng/μL的山羊、水牛乳DNA于離心管中，分別將不同比例的牛乳DNA與其混合，比例依次為5%、10%、50%、80%、90%，取1.0 μL上述混合DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以5%的摻假為方法的可應(yīng)用性的限度，并以單個(gè)物種DNA來(lái)源樣本熔解曲線為參考，對(duì)不同摻假比例的樣品進(jìn)行檢測(cè)，考察所建立的方法的實(shí)際應(yīng)用性，以及對(duì)摻假成分的相對(duì)定量。

2.7 PCR-HRM體系檢測(cè)實(shí)際樣品

為了驗(yàn)證本方法的實(shí)用性及準(zhǔn)確性，對(duì)市售的14種乳制品分別采用PCR-HRM和sanger測(cè)序進(jìn)行鑒定，確認(rèn)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)果與分析

3.1 通用引物的選取設(shè)計(jì)

經(jīng)篩選得到了一對(duì)通用引物，正向引物序列為5′-TTTGGTCCCAGCCTTCCTGTT-3′，反向引物序列為5′-CTTAGTCAAACTTTCGTTT-3′。利用BioEdit軟件比對(duì)該通用引物對(duì)應(yīng)的4個(gè)物種的完整擴(kuò)增序列(以山羊的擴(kuò)增序列為參照)。比對(duì)結(jié)果如圖1所示，圖中黑框范圍內(nèi)的是通用引物的堿基序列，圓點(diǎn)代表4個(gè)物種之間的相同堿基，可以很明顯地看到，4個(gè)物種的堿基之間有差異，說(shuō)明使用該通用引物，理論上可以區(qū)分出這4個(gè)不同的物種，其中序列差異最小的為水牛和牛，存在5%的序列差異，綿羊和奶牛的序列差異最大為13%，4個(gè)物種堿基序列平均差異約為10%。

圖1 通用引物對(duì)應(yīng)的4個(gè)物種的核苷酸序列差異對(duì)比Fig.1 Sequence alignment of four species corresponding to universal primers

3.2 PCR-HRM方法可行性分析

利用u-Melt軟件(https://dna-utah.org/umelt/quartz/)擬合通用引物對(duì)應(yīng)的牛、水牛、山羊、綿羊基因序列的高分辨熔解曲線，擬合結(jié)果如圖2-a所示。擬合得到4條獨(dú)立特異的熔解曲線，曲線之間可以相互區(qū)分，證明理論上可以通過(guò)高分辨熔解曲線區(qū)分4個(gè)物種(圖2-a)。進(jìn)一步用提取的DNA做PCR-高分辨熔解驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2-b，實(shí)驗(yàn)獲得的熔解曲線與理論擬合的曲線類似，其中水牛熔解曲線出現(xiàn)在最右端，因?yàn)槠浒行蛄泻休^高的GC，相反的，牛的靶序列GC比例最小，因此牛的熔解曲線位于最左側(cè)，通用引物對(duì)應(yīng)的牛和水牛基因序列差異最小，但采用熔解曲線分析可以明顯區(qū)分，且區(qū)分效果較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4個(gè)物種對(duì)應(yīng)的熔解曲線可以相互區(qū)分，因此驗(yàn)證了該鑒定方法用于山羊、綿羊、牛、水牛4個(gè)物種鑒別分析的可行性。圖2-c中將該通用引物用于擴(kuò)增其他物種以驗(yàn)證特異性，4個(gè)目標(biāo)物種均可以有效擴(kuò)增，此外擴(kuò)增曲線顯示鴿子、魚(yú)、豬的Ct在27，而B(niǎo)LAST結(jié)果顯示該對(duì)引物是無(wú)法擴(kuò)增這3個(gè)物種，因此該擴(kuò)增曲線可能由于樣本提取時(shí)受污染所致。瓊脂糖凝膠電泳圖中只有牛、水牛、山羊、綿羊有明顯條帶，且符合預(yù)期長(zhǎng)度，證明該通用引物對(duì)牛、水牛、山羊、綿羊具有通用性和對(duì)其他物種具有特異性。

a-擬合熔解曲線；b-實(shí)驗(yàn)熔解曲線；c-擴(kuò)增曲線及瓊脂糖凝膠電泳圖圖2 PCR-HRM可行性驗(yàn)證Fig.2 Verification of PCR-HRM feasibility注：圖c中M是marker，1～10泳道分別對(duì)應(yīng)于山羊、綿羊、牛、水牛、驢、馬、兔子、雞、鴨DNA

3.3 PCR-HRM體系檢測(cè)多元混合物結(jié)果

采用通用引物擴(kuò)增單組分(山羊、綿羊、牛、水牛)、二元混合物(山羊+牛、綿羊+牛、水牛+牛、山羊+水牛、山羊+綿羊、綿羊+水牛)、三元混合物(山羊+綿羊+牛、山羊+綿羊+水牛、綿羊+牛+水牛、山羊+牛+水牛)、四元混合物(山羊+綿羊+牛+水牛)，并對(duì)以上15種樣本進(jìn)行高分辨熔解，熔解結(jié)果見(jiàn)圖3。歸一化曲線圖中大部分樣本的曲線形狀獨(dú)特，可以相互區(qū)分，有幾個(gè)樣本的曲線發(fā)生了重疊，差異性很小。根據(jù)WITTWER等[18]的研究顯示，差異化曲線的區(qū)分效果更好，分析15種不同樣本對(duì)應(yīng)的差異化曲線，區(qū)分能力優(yōu)于歸一化熔解曲線，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。在圖3-c、圖3-d的二維和三維主成分分析圖中，同一樣本的3個(gè)平行被劃為1個(gè)聚類，含有不同物種的樣本分布在不同位置，混合物可以依據(jù)聚類位置相互區(qū)分。結(jié)果證明該方法可以對(duì)15種目標(biāo)物進(jìn)行鑒別，區(qū)分能力強(qiáng)大，適合多元混合物的摻假檢測(cè)。

3.4 PCR-HRM體系檢測(cè)不同摻假比例樣品

將山羊和牛的DNA按照不同比例混合，每個(gè)混合物做3個(gè)平行，進(jìn)行PCR-HRM檢測(cè)，分析由熔解曲線得到的主成分分析(principal component analysis，PCA)，結(jié)果如圖4-a所示，每個(gè)樣本的3個(gè)平行由于主成分相同被劃為1個(gè)聚類，最左和最右邊分別是100%牛和100%山羊，隨著牛DNA在樣本中占比增加，聚類逐漸靠近100%牛，說(shuō)明摻假比例和聚類在PCA圖中的PC1有一定的關(guān)系，因此以PCA圖中各聚類PC1數(shù)值的平均值為縱坐標(biāo)，混合比例為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.995。用相同的方法做牛和水牛DNA的摻假實(shí)驗(yàn)，得到相似結(jié)果，線性回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.998。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，摻入5%的外源物即可通過(guò)摻假獲得經(jīng)濟(jì)利益[22]，因此以5%為最低檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)證明可以檢測(cè)到占比為5%的牛DNA，確認(rèn)PCR-HRM可以實(shí)現(xiàn)對(duì)山羊乳DNA、水牛乳DNA中摻假牛乳DNA的相對(duì)定量。

a-歸一化熔解曲線；b-差異化熔解曲線；c-二維PCA分析圖；d-三維PCA分析圖圖3 PCR-HRM多元混合物檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Multivariate mixtures detection results by PCR-HRM

a-山羊和牛摻比PCA圖；b-山羊和牛摻比標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；c-水牛和牛摻比PCA圖；d-水牛和牛摻比標(biāo)準(zhǔn)曲線圖圖4 山羊、水牛和牛不同摻假比例樣品的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of pure goat and buffalo milk DNA mixed with bovine in progression proportions

3.5 市售樣品的應(yīng)用性檢測(cè)

因?yàn)榕Ｄ虄r(jià)格較低且含有過(guò)敏蛋白，所以采用建立的檢測(cè)方法測(cè)定了山羊和水牛乳及其制品中牛乳的摻假情況。對(duì)市售的14種乳制品進(jìn)行PCR-HRM實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置牛、山羊、水牛標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，依據(jù)不同品牌乳制品在PCA圖中的聚類分布位置確認(rèn)其主成分。檢測(cè)結(jié)果如表1所示，本文建立的方法一共檢測(cè)了12個(gè)主成分為牛和山羊乳的產(chǎn)品，其中有2個(gè)標(biāo)簽標(biāo)示為純山羊乳，卻檢測(cè)到牛的DNA，其余產(chǎn)品成分均與標(biāo)簽標(biāo)識(shí)成分一致。此外還對(duì)2種主成分為牛和水牛乳的產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示樣本13、14都含有牛和水牛2種成分，樣本13符合標(biāo)簽，樣本14不符合。通過(guò)對(duì)以上14種市售乳制品的檢測(cè)鑒定，確認(rèn)有3種乳制品的實(shí)測(cè)成分與標(biāo)簽不符，在純山羊乳、純水牛乳制品中摻入了牛乳成分。對(duì)樣品進(jìn)行Sanger測(cè)序，其中3組樣品的測(cè)序結(jié)果如圖5所示。樣品1、4、7分別為牛羊混合、純牛、純山羊，測(cè)序結(jié)果(擴(kuò)增序列77～102 bp)顯示，純山羊、純牛的測(cè)序峰都是單峰，沒(méi)有雜峰出現(xiàn)，而牛、山羊混合的樣品測(cè)序峰比較雜亂，并且出現(xiàn)了重疊峰，與本文建立方法的檢測(cè)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明基于通用引物的PCR-HRM具有實(shí)際應(yīng)用能力，可用于乳及乳制品的真實(shí)性鑒定。

表1 通用引物PCR-HRM反應(yīng)體系對(duì)市售牛、 山羊、水牛乳制品的檢測(cè)應(yīng)用Table 1 Application of PCR-HRM reaction system in the detection of bovine, goat, water buffalo milk products

圖5 部分市售乳制品測(cè)序結(jié)果Fig.5 Sanger sequencing results of some commercial dairy products

4 結(jié)論

本研究針對(duì)牛、水牛、山羊、綿羊的基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物，建立了基于通用引物的PCR-HRM檢測(cè)方法。該通用引物的PCR產(chǎn)物借助HRM分析可以成功區(qū)分以上4個(gè)物種，且不能擴(kuò)增其他物種，具特異性。同時(shí)該方法可鑒別多元混合物，具備分析復(fù)雜、多目標(biāo)樣本的能力，可以檢出摻假比例為5%的牛DNA，符合市場(chǎng)檢測(cè)需求。將該方法用于市售乳及其制品的鑒別，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，檢測(cè)結(jié)果可靠。與普通熔解曲線相比，高分辨熔解曲線因采用飽和染料具備更高的分辨率和區(qū)分能力，在分析同源性高的牛、水牛親緣物種時(shí)，也能顯示良好的區(qū)分效果。此外，PCR-HRM方法不用開(kāi)管操作，減小了檢測(cè)環(huán)境及待測(cè)樣本受PCR產(chǎn)物污染的可能性，并且操作簡(jiǎn)單，經(jīng)短時(shí)培訓(xùn)后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，更重要的是基于通用引物進(jìn)行PCR，可在1次反應(yīng)中同步檢測(cè)4個(gè)物種、檢測(cè)通量高、檢測(cè)成本低，適用于各類企業(yè)、廠家、研究所等。采用相同的方法優(yōu)化篩選相應(yīng)引物，所建立的方法也可用于牦牛奶、駱駝奶等高附加值乳制品的摻假分析，從而為食品中多種動(dòng)物源性成分的摻假檢測(cè)提供技術(shù)支撐。