油茶籽粕多糖羧甲基化、乙酰化修飾及其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用

楊建安 張 超 文焱炳 方 芳

(1.貴州省化工研究院，貴州 貴陽 550002；2.長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410114)

多糖是一類由不少于10個(gè)單糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的多羥基醛或者酮的高分子聚合物[1]。研究表明，天然植物多糖具有抗腫瘤[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]、抗輻射、抗衰老、保肝、抗菌[7]等多方面的生物活性作用。油茶籽粕是油茶籽經(jīng)機(jī)械榨油后的副產(chǎn)物，其中含有多糖、殘油、茶皂素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[8]。

油茶籽粕中含有20%～40%的油茶籽粕多糖(CamelliaOleiferaseed meal Polysaccharides，COP)[9]，但目前其利用率較低。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，大部分天然植物多糖都具有活性或只具有較弱的活性，其大多受多糖分子中化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，所以通過改變天然植物多糖的大分子結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、取代基團(tuán)種類、作用點(diǎn)位置和數(shù)量等就可以改變其理化性質(zhì)和生物活性，從而擴(kuò)大植物多糖的應(yīng)用范圍和利用率。多糖的羧甲基化及乙酰化修飾產(chǎn)物可能對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制活性產(chǎn)生積極影響[12-13]，但目前有關(guān)COP羧甲基化、乙酰化修飾及其修飾產(chǎn)物對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制活性影響尚未見報(bào)道。文章擬通過單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)COP羧甲基化及乙酰化修飾的影響規(guī)律，并探索不同取代度修飾產(chǎn)物對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制活性的影響，以期為COP更好的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽粕餅：市售；

氯乙酸、乙酸酐、羥基乙酸、鹽酸羥胺、三氯化鐵、2，7-二羥基萘、鄰苯三酚、水楊酸鈉、α-五乙酰基葡萄糖、透明質(zhì)酸酶等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫磁力攪拌器：85-2型，常州億通分析儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-201D型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

減壓抽濾裝置(循環(huán)水式真空泵)：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

真空干燥箱：DZF-6010型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

紫外分光光度計(jì)：723型，天津冠澤科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶籽粕多糖的制備 油茶籽粕經(jīng)干燥、粉碎、石油醚脫脂，在料液比1∶8(g/mL)、時(shí)間2 h、溫度70 ℃下，采用95%乙醇對(duì)茶皂素進(jìn)行脫除，離心收集沉淀。將脫除茶皂素的粉末按固液比1∶10(g/mL)加入蒸餾水，75 ℃下攪拌浸提3 h，離心后取上層清液，多次浸提合并上清液，即獲得COP水提液，將上清液旋蒸濃縮至原體積的1/4，用Sevage法除去蛋白，加入其4倍體積濃度為95%的乙醇，4 ℃醇沉24 h，離心，取上清液，沉淀冷凍干燥得COP。

1.3.2 羧甲基化修飾COP工藝研究 采用氫氧化鈉—氯乙酸法[14]。取240 mg COP，在NaOH濃度1.5 mol/L，反應(yīng)時(shí)間3 h，反應(yīng)溫度60 ℃下進(jìn)行羧甲基化修飾。采用控制變量法，選擇NaOH濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mol/L，反應(yīng)時(shí)間分別為1，2，3，4，5 h，反應(yīng)溫度分別為40，50，60，70，80 ℃，以羧甲基取代度為指標(biāo)，考察各單因素對(duì)羧甲基取代度的影響，確定羧甲基化修飾COP的最佳工藝。

1.3.3 乙酰化修飾COP工藝研究 采用乙酸酐法[15]。取100 mg COP，在乙酸酐用量3.0 mL，反應(yīng)時(shí)間3 h，反應(yīng)溫度60 ℃下進(jìn)行乙酰化修飾。采用控制變量法，選擇乙酸酐用量分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，反應(yīng)時(shí)間分別為1，2，3，4，5 h，反應(yīng)溫度分別為30，40，50，60，70 ℃，以乙酰基取代度為指標(biāo)，考察各單因素對(duì)乙酰基取代度的影響，確定乙酰化修飾COP的最佳工藝。

1.3.4 取代度的測定

(1)羧甲基取代度：采用分光光度法[12]。按式(1)計(jì)算羧甲基取代度。

(1)

式中：

DS1——羧甲基取代度；

A——多糖中羥基乙酸百分含量，%。

(2)乙酰基取代度：采用羥胺比色法[16]。按式(2)計(jì)算乙酰基取代度。

(2)

式中：

DS2——乙酰基取代度；

M——多糖中乙酰基百分含量，%。

1.3.5 COP、CM-COP和Ac-COP的紅外光譜表征 取COP、CM-COP和Ac-COP干燥后樣品各6 mg，分別與100 mg已烘干的KBr混合，研磨，壓片，使用紅外光譜儀于4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描[17]。

1.3.6 溶解度分析 稱取一定量的COP、CM-COP及Ac-COP，加入20 mL蒸餾水，震蕩至充分均勻，觀察其在冷水、加熱或超聲輔助條件下的溶解情況，并采用紫外可見分光光度計(jì)掃描其水溶液的透光率(400～600 nm)。

1.3.7 COP、CM-COP和Ac-COP對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用 取50 μL一定濃度的COP、CM-COP和Ac-COP，分別加入4.85 mL乙酸—乙酸鈉溶液(pH 6.0，0.2 mo1/L)及50 μL 透明質(zhì)酸酶(1 mg/mL)，充分搖勻，37 ℃下加入50 μL透明質(zhì)酸鈉(3.44 mg/mL)，反應(yīng)15 min，加入2 mL 2.5%的CTAB(溶于2%氫氧化鈉溶液)，15 min后，測定400 nm處吸光度A1，樣品對(duì)照(緩沖液代替酶液)吸光度為AC1，空白對(duì)照(緩沖液代替酶液和樣品溶液)吸光度為AC2，用緩沖液代替樣品測吸光度A0[18]。按式(3)計(jì)算抑制率。

(3)

式中：

R——抑制率，%；

A1——樣品吸光度；

AC1——樣品對(duì)照(緩沖液代替酶液)吸光度；

AC2——空白對(duì)照(緩沖液代替酶液和樣品溶液)吸光度；

A0——緩沖液代替樣品吸光度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2016、Origin 2018、SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，P<0.05有顯著性差異。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基化修飾單因素試驗(yàn)

2.1.1 NaOH濃度 由圖1可知，當(dāng)NaOH濃度<1.5 mol/L時(shí)，CM-COP取代度隨NaOH濃度的升高而升高，但當(dāng)NaOH濃度>1.5 mol/L時(shí)，CM-COP取代度開始下降。因此，NaOH濃度太高或太低，都會(huì)影響COP的羧甲基化效果。這可能是因?yàn)殡S著NaOH濃度的不斷升高，由于空間位阻，使得COP溶脹得更為充分，與氯乙酸接觸的機(jī)會(huì)也增多，醚化反應(yīng)效率提高，從而使反應(yīng)取代度增加。但溶液中NaOH過量，氯乙酸可能發(fā)生副反應(yīng)，使其利用率降低，反而使取代度降低。因此，當(dāng)NaOH濃度為1.5 mol/L時(shí)，取代度達(dá)最大0.665。

圖1 NaOH濃度對(duì)CM-COP的影響

2.1.2 反應(yīng)溫度 由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)溫度<60 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，CM-COP的取代度逐漸升高，但當(dāng)反應(yīng)溫度>60 ℃時(shí)，取代度呈下降趨勢，說明適當(dāng)提高反應(yīng)溫度有利于羧甲基的修飾，但溫度過高不利于羧甲基的取代。這可能是因?yàn)闇囟炔粩嗌撸涌炝朔肿舆\(yùn)動(dòng)速度，增加了分子間相互碰撞機(jī)會(huì)，致使多糖取代度增加。因此，選擇反應(yīng)溫度60 ℃為宜。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)CM-COP的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間 由圖3可知，當(dāng)NaOH濃度和反應(yīng)溫度一定時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，CM-COP取代度逐漸提高。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間>3 h時(shí)，CM-COP的取代度反而有所降低，可能是因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)時(shí)間為1～3 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)活性中心增多，醚化反應(yīng)速率加快，因此CM-COP的取代度顯著增加。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過3 h后，可能其體系內(nèi)副產(chǎn)物增多或不穩(wěn)定，導(dǎo)致中間產(chǎn)物分解，造成取代度降低。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間為3 h，此時(shí)取代度為0.665。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CM-COP的影響

2.1.4 不同取代度CM-COP的制備 根據(jù)COP羧甲基化修飾單因素試驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整反應(yīng)條件，制備CM-COP-A、CM-COP-B、CM-COP-C、CM-COP-D 4種不同取代度的CM-COP，其羧甲基取代度及制備工藝見表1。

表1 CM-COP的制備條件及取代度

圖4 COP及CM-COP的紅外光譜圖

2.1.6 羧甲基化多糖的溶解性 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在同濃度條件下，用氯乙酸法制得的CM-COP與COP相比，在加熱或超聲波等外界輔助條件下，溶解度均有不同程度的提高，其修飾產(chǎn)物在冷水中稍稍振蕩即可溶解。由圖5可知，同一濃度條件下，CM-COP水溶液的透光率明顯高于COP溶液，說明羧甲基化修飾能提高其水溶性。

圖5 COP及CM-COP水溶液的透光率

2.2 乙酰基化修飾單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙酸酐用量 由圖6可知，取代度隨乙酸酐用量的增加而上升，可能是因?yàn)殡S著乙酸酐用量的增多，增加了COP乙酰化的反應(yīng)幾率，乙酰基取代度也隨之增加。但當(dāng)乙酸酐用量>3 mL時(shí)，COP乙酰基的取代度逐漸下降，可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系的pH值隨乙酸酐的增加逐漸下降，增大了乙酸酐水解的副反應(yīng)程度。因此適宜的乙酸酐用量為3 mL，此時(shí)取代度為0.400。

圖6 乙酸酐用量對(duì)Ac-COP的影響

2.2.2 反應(yīng)溫度 由圖7可知，一定程度的反應(yīng)溫度有利于COP的乙酰化修飾。當(dāng)反應(yīng)溫度為30～60 ℃時(shí)，隨反應(yīng)溫度升高，COP的乙酰基取代度幾乎呈直線增加，可能是在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，反應(yīng)物活性越強(qiáng)，COP乙酰基取代度隨之增大。但當(dāng)反應(yīng)溫度>60 ℃時(shí)，乙酰基取代度快速下降，說明溫度太高并不利于COP的乙酰化反應(yīng)，可能是當(dāng)反應(yīng)溫度>60 ℃時(shí)，乙酸酐的水解速度過快，導(dǎo)致COP乙酰基的取代度減小。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)Ac-COP的影響

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間 由圖8可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1～3 h時(shí)，Ac-COP乙酰基的取代度隨反應(yīng)時(shí)間的延長而提高，3 h后，Ac-COP乙酰基的取代度隨反應(yīng)時(shí)間的延長而下降，可能是因?yàn)锳c-COP在體系中并不穩(wěn)定，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，部分產(chǎn)物發(fā)生分解，引起乙酰化程度降低。因此，COP的乙酰化修飾的較佳反應(yīng)時(shí)間應(yīng)為3 h。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ac-COP的影響

2.2.4 不同取代度Ac-COP的制備 根據(jù)對(duì)COP乙酰化修飾的3個(gè)影響因素的研究結(jié)果，調(diào)整反應(yīng)條件，制備由低到高4種不同取代度的Ac-COP(Ac-COP-A、Ac-COP-B、Ac-COP-C、Ac-COP-D)，其乙酰基取代度及制備工藝見表2。

表2 Ac-COP的制備條件及取代度

圖9 COP及Ac-COP的紅外光譜圖

2.2.6 乙酰化多糖的溶解性 由圖10可知，同一濃度條件下，Ac-COP水溶液的透光率明顯高于COP溶液，說明乙酰化修飾可明顯提高COP在水溶液中的溶解性。

圖10 COP及Ac-COP水溶液的透光率

2.3 COP、CM-COP和Ac-COP對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用

2.3.1 羧甲基化修飾 由圖11可知，COP和不同取代度的CM-COP均對(duì)透明質(zhì)酸酶活性具有良好的抑制作用，且抑制能力有明顯濃度依賴性，即隨著樣品濃度的增加其抑制率不斷提高。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，COP、CM-COP-A、CM-COP-B、CM-COP-C、CM-COP-D對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為51.1%，53.3%，56.3%，61.3%，63.7%，與COP相比，不同取代度的CM-COP對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制能力均有一定程度的提高，且隨取代度的增加抑制率越大，說明COP的羧甲基化有利于增加COP的透明質(zhì)酸酶抑制活性。這可能是羧甲基化后多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響抑制透明質(zhì)酸酶的活性，其具體機(jī)理有待深入研究。綜上，不同取代度的CM-COP均有利于增強(qiáng)COP對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用。

圖11 COP及CM-COP對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用

2.3.2 乙酰化修飾 由圖12可知，COP及其不同取代度的Ac-COP均對(duì)透明質(zhì)酸酶的活性抑制有明顯作用。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL時(shí)，COP、Ac-COP-A、Ac-COP-B、Ac-COP-C、Ac-COP-D對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制率分別為50.9%，54.5%，58.3%，61.8%，65.3%。與COP相比，Ac-COP對(duì)透明質(zhì)酸酶活性具有更好的抑制作用，且抑制能力有明顯濃度依賴性。這可能是因?yàn)榻?jīng)乙酰化修飾后的Ac-COP中乙酰基含量增加，從而導(dǎo)致COP的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，活性提高。綜上，COP的乙酰化修飾有利于增加COP對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用。

圖12 COP及Ac-COP對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用

3 結(jié)論

通過氫氧化鈉—氯乙酸法和乙酸酐法分別探究了羧甲基化油茶籽粕多糖和乙酰化油茶籽粕多糖的修飾工藝。結(jié)果表明，羧甲基化油茶籽粕多糖的最佳修飾工藝條件為：NaOH濃度2 mol/L、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h；乙酰化油茶籽粕多糖的最佳修飾工藝條件為：乙酸酐用量3 mL，反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h。油茶籽粕多糖及其兩種修飾多糖均具有多糖的顯著特征峰，3 413，2 930，1 611，1 420，1 323 cm-1等特殊峰值處均具有明顯峰，表示羧甲基化修飾成功；3 413，2 930，1 724，1 247 cm-1等特殊峰值處均具有明顯峰，表示乙酰化修飾成功。油茶糖、羧甲基化油茶籽粕多糖和乙酰化油茶籽粕多糖均對(duì)透明質(zhì)酸酶活性具有良好的抑制作用，且抑制能力有明顯濃度依賴性。后續(xù)將進(jìn)一步探索羧甲基化及乙酰化油茶籽粕多糖在體內(nèi)對(duì)于透明質(zhì)酸酶的活性作用情況及作用機(jī)理。