重樓皂苷Ⅶ抑制Wnt/β-catenin信號減少白細胞介素-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡和炎癥介質分泌

李真 李婕 黃賢明 孟凡力

(青島市中醫醫院(青島市海慈醫院) 1藥劑科，山東 青島 266011；2血管外科；3內分泌科)

骨關節炎常見于60歲以上老年人，其治療以減輕疼痛、恢復和重建關節功能為主，骨關節的發生涉及炎癥、細胞因子、軟骨細胞凋亡等一系列復雜過程〔1〕。白細胞介素(IL)-1β是誘導骨關節炎發生的重要因子，可進一步加重細胞炎癥損傷，促進細胞凋亡，造成骨關節破壞〔2〕。重樓皂苷Ⅶ是一種重樓的活性成分，有抗腫瘤、消炎、抗骨質疏松等作用〔3〕。重樓皂苷Ⅶ具有抗骨關節炎的作用，其治療后的骨關節炎大鼠模型關節炎病理損傷明顯改善，炎癥因子水平降低〔4〕。現階段尚不清楚重樓皂苷Ⅶ對IL-1β誘導的關節軟骨細胞作用。本研究旨在探討重樓皂苷Ⅶ對IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡和炎癥介質釋放的影響和機制。

1 材料與方法

1.1材料 細胞：人關節軟骨細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司，編號：CP-H096)，人關節軟骨細胞培養在含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養液中，細胞培養條件為37℃，5% CO2培養箱。藥物：重樓皂苷Ⅶ(四川省維克奇生物科技有限公司，規格：20 mg，編號：wkq-00731，純度：≥ 98%)。試劑與儀器：腫瘤壞死因子(TNF)-α含量檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；兔抗c-myc抗體購自美國Abcam；IL-8含量檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)抗體購自美國Abcam；一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗β-連環蛋白(catenin)抗體購自美國Cell Signaling Technology；Wnt/β-catenin信號激活劑LiCl購自美國Sigma；兔抗剪切的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗體購自美國Abcam；IL-6含量檢測試劑盒購自杭州康知生物科技有限公司；流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特；SpectraMax iD5型酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2分組和給藥方法 根據處理方法不同，將關節軟骨細胞分成對照組、IL-1β組、重樓皂苷Ⅶ低劑量組、重樓皂苷Ⅶ中劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組。取對數期的關節軟骨細胞，根據不同的實驗需求，分別接種到不同的細胞培養板內，細胞接種密度為5×104個/ml，細胞貼壁后，分別按照對照組、IL-1β組、重樓皂苷Ⅶ低劑量組、重樓皂苷Ⅶ中劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組分組方法處理，IL-1β組加入終濃度為10 ng/ml IL-1β〔2〕，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組細胞培養液中同時分別添加終濃度為0.1、0.2、0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組細胞培養液中添加終濃度為0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ和20 mmol/L Wnt/β-catenin信號激活劑LiCl〔5〕。對照組以常規方法培養。

1.3CCK-8實驗檢測細胞增殖 關節軟骨細胞接種到96孔板內，按照1.2中方法處理或給予0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理，細胞培養24 h后，在每個孔內添加CCK-8溶液10 μl，放在37℃環境孵育4 h。用酶標儀測定490 nm的OD值，以對照組細胞存活率為100%，分析其余各組細胞存活率變化。

1.4Western印跡方法檢測蛋白表達 關節軟骨細胞接種到12孔板內，按照1.2中方法處理，細胞培養24 h后，添加細胞裂解試劑提取細胞總蛋白，將蛋白樣品與2倍上樣緩沖液混合煮沸5 min。根據蛋白分子量大小配制分離膠和濃縮膠，每個上樣孔內添加40 μg，在濃縮膠中使用100 V電壓電泳，在分離膠中使用120 V的電壓電泳。濕轉法轉膜，轉膜電壓設置為90 V，轉膜90 min。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在5%脫脂奶粉中，室溫結合2 h，然后把PVDF膜放在一抗溶液(酶切Caspase-3一抗按照1∶600稀釋，β-catenin、c-myc、iNOS一抗按照1∶1 000稀釋)中，4℃結合過夜，PVDF膜放在二抗溶液(二抗按照1∶4 000稀釋)中，室溫結合2 h。電化學發光法(ECL)顯色，TANON GIS 軟件分析條帶的灰度值，GAPDH作為內參，分析目的蛋白表達變化。

1.5流式細胞術檢測凋亡 關節軟骨細胞接種到12孔板內，按照1.2方法處理，細胞培養24 h以后，收集細胞，用冰預冷后的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，最后將細胞懸浮在300 μl結合緩沖液中，依次添加5 μl Annexin V-FITC和PI溶液，分別在室溫中避光反應20 min，在用流式細胞儀檢測前再添加200 μl結合緩沖液。

1.6微量法檢測NO含量 關節軟骨細胞接種到12孔板內，按照1.2中方法處理，細胞培養24 h以后，收集細胞培養液上清，用NO含量檢測試劑盒測定NO含量。

1.7統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1重樓皂苷Ⅶ對關節軟骨細胞增殖的影響 0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理關節軟骨細胞存活率分別為(100.00±10.58)%、(97.96±8.54)%、(96.45±11.26)%、(94.11±12.32)%、(82.02±7.22)%、(63.05±5.17)%。與0.0 μmol/L比較，0.1、0.2、0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理后的關節軟骨細胞存活率沒有變化，而0.8、1.6 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理后的關節軟骨細胞存活率明顯降低(P<0.05)。選擇對關節軟骨細胞增殖沒有毒性作用的0.1、0.2、0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ做后續實驗。

2.2重樓皂苷Ⅶ抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞中Wnt/β-catenin信號激活 與對照組比，IL-1β組關節軟骨細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關節軟骨細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達量逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關節軟骨細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；見圖1和表1。

1～6：對照組、IL-1β組、重樓皂苷Ⅶ低劑量組、重樓皂苷Ⅶ中劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組；圖3，圖4同圖1 各組關節軟骨細胞中Wnt/β-catenin信號相關蛋白表達

表1 各組關節軟骨細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達量比較

2.3重樓皂苷Ⅶ調控Wnt/β-catenin影響IL-1β誘導的關節軟骨細胞增殖和凋亡 與對照組比，IL-1β組關節軟骨細胞存活率顯著降低，凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關節軟骨細胞存活率逐漸升高，凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達量逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關節軟骨細胞存活率顯著降低，凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；見圖2，表2，圖3。

圖2 各組關節軟骨細胞凋亡情況

表2 各組關節軟骨細胞存活率、凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達及關節軟骨細胞分泌炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-8含量比較

圖3 各組關節軟骨細胞中酶切Caspase-3蛋白表達

2.4重樓皂苷Ⅶ調控Wnt/β-catenin影響IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥因子分泌 與對照組比，IL-1β組關節軟骨細胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-8含量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關節軟骨細胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-8含量逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關節軟骨細胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-8含量顯著升高(P<0.05)；見表2。

2.5重樓皂苷Ⅶ調控Wnt/β-catenin影響IL-1β誘導的關節軟骨細胞中NO分泌 與對照組比，IL-1β組關節軟骨細胞分泌的NO含量顯著升高，iNOS蛋白表達量顯著增多(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關節軟骨細胞分泌的NO含量逐漸降低，iNOS蛋白表達量逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關節軟骨細胞分泌的NO含量顯著升高，iNOS蛋白表達量顯著增多(P<0.05)；見圖4和表3。

1～6:對照組，IL-1β組，重樓皂苷Ⅶ低劑量組，重樓皂苷Ⅶ中劑量組，重樓皂苷Ⅶ高劑量組，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組圖4 各組關節軟骨細胞中iNOS蛋白表達

表3 各組關節軟骨細胞分泌NO含量和iNOS蛋白表達量比較

3 討 論

骨關節炎主要累及運動關節，骨關節炎軟骨細胞炎癥損傷、過度凋亡是骨關節炎發生的重要原因〔6〕。病理條件下，關節軟骨細胞受到炎癥因子的作用后，可進一步分泌炎癥介質，激活細胞凋亡途徑，誘導細胞凋亡〔7〕。IL-1β是骨關節炎損傷的重要誘導因子，可加快關節軟骨細胞凋亡，加快骨關節炎進展〔2,8〕。IL-6、TNF-α、IL-8是骨關節炎進展中的炎癥誘導因子，其表達上調促進炎癥反應，誘導細胞凋亡相關蛋白酶切Caspase-3表達，促進細胞凋亡〔9〕。生理狀態下的NO是細胞信號傳遞者，與心肺功能、腸胃保護、血壓調節等有關，而在病理狀態下，NO可作為炎癥介質介導炎癥反應，促進細胞凋亡發生；NO的合成受到一氧化氮合酶的作用，一氧化氮合酶有兩大類，其中iNOS是病理條件下NO合成的主要蛋白酶〔10～12〕。已經有研究表明〔13〕，骨關節炎進展中NO合成水平大大增加，iNOS水平升高。本研究說明IL-1β誘導骨關節軟骨細胞損傷，成功構建了體外骨關節炎軟骨細胞模型。

重樓皂苷Ⅶ有較高的生物學活性，能夠調控免疫力、抑制腫瘤生長、抑制炎癥〔3〕。重樓皂苷Ⅶ對骨關節炎也有抑制作用，重樓皂苷Ⅶ降低大鼠骨關節炎模型關節組織中炎癥因子IL-6、TNF-α含量，減輕病理損傷〔4〕。本研究結果提示重樓皂苷Ⅶ改善體外骨關節炎軟骨細胞損傷，減少炎癥介質釋放，抑制細胞凋亡，與以前的研究結果一致〔13〕，均說明重樓皂苷Ⅶ可能具有抗骨關節的功效。

重樓皂苷Ⅶ發揮藥理學作用的機制復雜，可調控信號通路的轉導發揮作用〔14〕。β-catenin、c-myc分別為Wnt/β-catenin信號通路的關鍵因子和下游靶基因，二者表達改變與Wnt/β-catenin信號激活程度有關〔15～18〕。Wnt/β-catenin信號在細胞生長、衰老、炎癥、免疫調控等方面均有作用，且與腫瘤、動脈粥樣硬化等發生有關〔19,20〕。在骨關節炎進展中Wnt/β-catenin信號過度激活，且抑制Wnt/β-catenin信號可改善骨關節炎軟骨細胞損傷〔5〕。本研究結果重樓皂苷Ⅶ通過抑制Wnt/β-catenin信號減少體外骨關節炎軟骨細胞炎癥介質釋放，抑制細胞凋亡，改善細胞損傷。

綜上，重樓皂苷Ⅶ有抗骨關節軟骨細胞損傷的作用，可以抑制IL-1β誘導的骨關節軟骨細胞炎癥介質釋放，減少細胞凋亡，作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號有關。目前對重樓皂苷Ⅶ調控Wnt/β-catenin信號的具體機制還不清楚，在后續實驗中會繼續研究。