板藍根花葉病病原分子鑒定△

魏若凡，王蓉，李勇，丁萬隆

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

板藍根Isatidis Radix 是十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥根，具有清熱解毒、清涼利咽之功效[1]。近年來，板藍根病毒病頻發，成為影響板藍根產量和藥用品質的重要病害。2020 年9 月，在對安徽省太和縣板藍根進行病害調查時發現板藍根花葉病，其癥狀表現為葉片皺縮、花葉，根系變小，病害發生率為5%～10%。目前，已鑒定出板藍根花葉病的病原包括黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和蠶豆萎蔫病毒2 號（broad bean mosaic virus 2，BBWV2）[2-3]。另外，馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus）也是引起花葉病的一類重要病原，可能造成板藍根花葉病[4]1069。通過對病毒外殼蛋白（coat protein，CP）基因進行序列測定、BLASTn 分析和系統發育進化樹構建，分析病毒的序列特征和分類地位，為板藍根花葉病的監測和防控提供參考。

1 材料

1.1 樣品

板藍根花葉病病葉于2020 年9 月采集自安徽省太和縣（N33°30′54″，E115°31′28″，海拔40 m），葉片呈現黃綠相間的花葉癥狀并出現皺縮（圖1），由中國醫學科學院藥用植物研究所王蓉副研究員鑒定為板藍根花葉病病葉，編號為BLG1～BLG5。

圖1 板藍根花葉病田間癥狀

1.2 試藥

TRNzol（批號：R6801）、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑（批號：U8908）、質粒小提試劑盒（批號：U8904）均購自天根生化科技（北京）有限公司；M-MLV 反轉錄酶（批號：AG70412A，北京拜爾迪生物技術有限公司）；pMD19-T Vector（批號：AHF1958A）、T4 DNA Lingas（批號：AKE2060A）、Ex TaqDNA polymerase（批 號：AJE0795A）、RNase Inhibitor（批號：AH40401A）均購自大連寶生物股份有限公司；dNTPs（批號：N10219）、random hexamers primer（批號：K31126）、Oligo（dT）18（批號：K20608）、大腸桿菌DH-5α 感受態細胞（批號：N1290610）均購自北京全式金生物技術有限公司。引物合成和序列測定由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3 儀器

Fresco 21 型冷凍高速離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；Research plus 型移液器（Eppendorf 公司）；T100 型基因擴增儀（Bio-Rad 公司）；ChampGel 5000 型全自動凝膠成像儀（北京賽智創業科技有限公司）；DYY-6C 型電泳儀、DYCP-31E 型電泳槽均購自北京市六一生物科技有限公司；DH6000型電熱恒溫培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；YT-CJ-1D 型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司）；ZHWY-100H 型恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 葉片總RNA提取

參照TRNzol Universal總RNA 提取試劑說明書，使用TRNzol 試劑提取板藍根葉片總RNA，獲得的總RNA置于-80 ℃保存備用。

2.2 RT-PCR檢測

以1 μg總RNA為模板，random hexamers primer為引物，在M-MLV 反轉錄酶作用下合成RNA 鏈的互補cDNA 鏈。反應體系及操作步驟參照M-MLV 反轉錄酶使用說明書。獲得的cDNA 置于-20 ℃保存備用，用于CMV、BBWV2 和Potyvirus檢測，檢測引物參照文獻合成[5-7]，擴增區域均為病毒的CP基因（表1）。取聚合酶鏈式反應（PCR）產物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳。使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒純化回收目標條帶并將目標條帶連接到pMD19-T 載體，每個片段選取3 個陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司測序。

表1 板藍根花葉病病毒檢測引物

2.3 CMV CP序列比對分析

序列比對分析采用DNAMAN 6.0軟件和美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn 程序。GenBank 數據庫下載13 個代表性CMV 株系/分離物，使用MEGA X軟件[8]中的ClustalW程序進行序列比對，使用鄰接法（neighbor joining，NJ）根據CMV CP 氨基酸序列構建系統發育進化樹，Bootstrap 法（重復數為1000）評估系統發育進化樹?；ㄉ《荆╬eanut stunt virus，PSV）的ER 株系（PSV-ER）作為遠源關系參照。

3 結果

3.1 RT-PCR檢測結果

經RT-PCR，CMV 特異引物在BLG1～BLG5 中均擴增到1 條657 bp 的條帶（圖2）。BBWV2 特異引物和Potyvirus簡并引物在上述樣品中未擴增到條帶。將BLG3、BLG4 擴增條帶回收純化，連入pMD19-T 載體進行測序，獲得AH-BLG3 和AHBLG4 分離物序列（GenBank 登錄號：MW251398和MW251399），2 條片段均包含完整的CP基因，預計編碼218 aa。序列比對分析發現，AH-BLG3 和AH-BLG4 分離物核苷酸和氨基酸序列相似度分別為99.39%和100%。BLASTn分析結果顯示，AH-BLG3和AH-BLG4 與我國白術上的CMV ZJAm 分離物（MK421103）相似度最高，核苷酸相似度分別為99.54%和98.93%，氨基酸相似度均為100%。上述結果明確了安徽省太和縣板藍根花葉病的病原為CMV。

圖2 RT-PCR檢測CMV

3.2 CMV安徽板藍根分離物系統進化分析

基于CMV CP 氨基酸序列構建系統發育進化樹顯示，上述所有CMV分離物分為Ⅰ組和Ⅱ組，其中Ⅰ組又可分為ⅠA 和ⅠB 亞組[9-10]。其中，AH-BLG3和AH-BLG4 分離物均屬于ⅠB 亞組，與白術ZJAm分離物和玉米Anhui 分離物聚為一支，親緣關系最近。AH-BLG3 和AH-BLG4 與北京地區板藍根上分離到的CMV-Ii 分離物分屬ⅠB 亞組的不同分支（圖3）。

圖3 基于CMV CP氨基酸序列的NJ系統發育進化樹

比較安徽省和北京地區板藍根CMVCP序列發現，AH-BLG3 和AH-BLG4 與CMV-Ii 分離物核苷酸序列相似度分別為98.17%和97.87%，氨基酸序列相似度均為99.08%，氨基酸在第91 位（T/L）和第168位（H/Y）存在差異（圖4）。

圖4 板藍根CMV分離物CP氨基酸序列比對

4 討論

植物病毒病是威脅藥用植物產量和品質的重要病害，病原種類繁多且復雜。1 種藥用植物可以受到多種病毒侵染，如太子參花葉病的病原有CMV、BBWV2、蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）[11]；1 種病毒也可危害多種藥用植物，如CMV 可侵染百合[12]、半夏[13]、三七[14]、白術[15]、柴胡[16]、丹參[17]、薄荷[18]等100 余科1200 余種植 物[2]。BBWV2 可侵染毛地黃[19]、柴胡[16]、白術[20]等藥用植物。馬鈴薯Y 病毒屬是植物病毒中最大的屬。該屬病毒可侵染多種藥用植物。例如，TuMV 可侵染太子參[11]、金蓮花[21]；馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）可侵染懷山藥[22]、菊花[23]；芋頭花葉病毒（dasheen mosaic virus，DsMV）可侵染半夏、天南星等[24]。

板藍根是清熱解毒類中藥的代表。近年來，常有板藍根花葉病的報道，本研究使用CMV、BBWV2的特異性檢測引物和Potyvirus的簡并引物，通過RT-PCR 方法對安徽省太和縣板藍根花葉病的病原進行鑒定，確定其病原為CMV，屬于ⅠB 亞組。逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測板藍根花葉病也存在一定的局限性。該方法僅能檢測特定病毒，板藍根葉片中是否還有其他病毒需通過高通量測序進一步確認。

藥用植物病毒病的檢測方法主要有生物學檢測、電子顯微鏡檢測、血清學檢測、分子生物學檢測等。徐潔[25]用普通煙草、洋酸漿等檢測侵染馬鈴薯的PVY；李明軍等[22]用電子顯微鏡檢測出侵染懷山藥的PVY；吳志明等[17]用DAS-ELISA 試劑盒檢測到侵染丹參的CMV；王寶霞等[3]用非依賴性PCR 和RT-PCR 檢測出侵染板藍根的BBWV2。各檢測方法有各自的優缺點。在實際工作中，應根據不同的檢測條件及檢測目的，選擇合適的檢測方法。

植物病毒病的防治主要以預防為主，植株一旦發病，無有效的防治藥劑。防治方法主要有：1）對種子、種苗和無性繁殖材料進行檢驗和檢疫；2）通過莖尖組織培養進行脫毒；3）選育抗病品種；4）加強田間管理，培育壯苗；5）防治介體昆蟲，防止病毒傳播等[26]。自然界中CMV 主要通過蚜蟲等蟲媒以非持久方式傳播，也可通過機械傳播[4]965。因此，板藍根種植過程中應特別注意加強傳毒媒介的防治，及時清除帶毒植株，機械收割大青葉時注意農具消毒。板藍根多以種子繁殖，仍需實驗證明CMV 是否通過板藍根種子傳播。本研究結果證明，不同產區的板藍根植株攜帶的病毒具有地域特異性，生產上應加強不同板藍根產區病毒病發生及為害情況監測。