星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化野扇花顆粒制備工藝及其藥效學(xué)研究△

邱宏聰，韋桂寧，何開家，陳明生，梁冰

廣西中醫(yī)藥研究院/廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西 南寧 530022

野扇花為黃楊科植物Sarcococca ruscifoliaStapf.的干燥全株，是廣西、貴州等地少數(shù)民族常用的民間草藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，味辛、苦，性平，具有行氣活血、祛風(fēng)止痛之功效，用于胃脘疼痛、風(fēng)寒濕痹、跌打損傷[1]。野扇花富含甾體類生物堿等化學(xué)成分，其藥理活性作用主要為緩解胃腸道癥狀[2]。近年來，本課題組將野扇花作為治療胃痛、胃潰瘍的單方藥物，泡酒使用，先后在廣西都安縣人民醫(yī)院及廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院使用，具有療效確切、治愈率高的特點。本研究制備野扇花顆粒采用星點設(shè)計（CCD）-效應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，完成制劑抗胃潰瘍、鎮(zhèn)痛等藥效學(xué)實驗研究，為野扇花的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

XS205 型分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；GJ-8402型熱板測痛儀（浙江寧海白石電子醫(yī)療儀器廠）；XYH-2A型體視顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

對照品矮陀陀胺堿A（上海源葉生物科技公司，批號：30007-2013，純度>98%）；乙醇、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純；鹽酸雷尼替丁膠囊（廣東逸舒制藥有限公司，批號：201407040.15 g/粒）；羅通定片（山東明仁福瑞達制藥股份有限公司，批號：130301，30 mg/片）；野扇花顆粒（廣西中醫(yī)藥研究院自制）。

昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，雌雄兼用，清潔級，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物許可證號：SCXK 桂2014-0002，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥研究院SPF級動物房。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 野扇花總生物堿含量測定 取本品細(xì)粉約1 g，精密稱定，加入鹽酸50 mL，超聲30 min，濾過，精密量取上清液10 mL，用濃氨試液調(diào)pH 至10，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加乙醇5 mL使溶解并轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，精密加入鹽酸滴定液（0.01 mol·L-1）10 mL，搖勻，加甲基紅指示劑3～4 滴，用氫氧化鈉滴定液（0.01 mol·L-1）滴定，即得。每毫升鹽酸滴定液（0.01 mol·L-1）相當(dāng)于1.80 mg 矮陀陀胺堿A（C24H41NO）。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別按照取樣量的40%、60%、80%、100%、120%、140%、160%稱取不同質(zhì)量的本品細(xì)粉，按2.1.1 項下方法，記錄測定結(jié)果，以供試品質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）、鹽酸滴定液體積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性回歸方程：Y=1.673X-0.120（r=0.999 5），線性 關(guān)系良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號：140301），按2.1 項下方法平行測定6 份，6 份野扇花總生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.78 mg·g-1，RSD 為1.87%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 加樣回收率試驗 取2.1.3 項下的樣品約0.5 g，平行6 份樣品，分別精密加入矮陀陀酰胺堿A 對照品溶液（0.724 mg·mL-1）2 mL，按2.1 項下方法提取、測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為96.45%，RSD 為2.43%，結(jié)果表明本方法回收率良好。

2.2 提取溶劑的選擇

對提取溶劑的選擇采用單因素考察，采用30%、50%、70%乙醇分別對野扇花進行回流提取，結(jié)果總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.65、3.09、3.13 mg·g-1，50%、70%乙醇提取結(jié)果相近，從節(jié)約成本因素考慮，采用50%乙醇作為提取溶劑。

2.3 CCD效應(yīng)面法優(yōu)化野扇花顆粒制備工藝

2.3.1 野扇花顆粒制備方法 取野扇花，用50%乙醇回流提取，濾液合并，濃縮至相對密度為1.30～1.35（60 ℃）的稠膏，加入適量蔗糖，混勻，制成顆粒，干燥，裝袋，即得。

2.3.2 效應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)CCD 效應(yīng)面試驗設(shè)計原理，以影響野扇花總生物堿提取率的主要因素料液比（A）、提取次數(shù)（B）、提取時間（C）為自變量，采用3因素3水平效應(yīng)面方法，因素水平見表1。以總生物堿含量作為指標(biāo)，效應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 CCD效應(yīng)面優(yōu)化野山花顆粒制備工藝試驗因素水平

表2 野山花顆粒CCD效應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.3 數(shù)據(jù)處理與方差分析 采用Design Expert 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到回歸方程：Y=2.91+0.14A+0.61B+0.088C-0.063AB-0.0025AC+0.10BC-0.10A2-0.61B2+0.055C2。根據(jù)回歸方程進行方差分析（表3），影響總生物堿含量各變量的主次順序為B>A>C，其中提取次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），料液比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提取時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，模型回歸方程具有顯著意義（P<0.05），失擬項結(jié)果不顯著，說明所選用的回歸方程良好。

表3 野山花顆粒CCD效應(yīng)面模型方差分析結(jié)果

2.3.4 效應(yīng)面分析及優(yōu)化 采用Design Expert 8.0軟件，根據(jù)回歸方程分析結(jié)果，以1個因素固定于0水平，剩余2 個因素相互作用，分別繪制三維效應(yīng)面圖，見圖1～3，可直觀分析各因素對總生物堿含量的影響及因素間的相互作用。Design Expert 8.0軟件計算出13 種優(yōu)化方案，其中最優(yōu)預(yù)測方案：料液比為1∶12.51，提取次數(shù)為2.55 次，提取時間為120 min，總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.29 mg·g-1。結(jié)合效應(yīng)優(yōu)化分析結(jié)果，綜合考慮生產(chǎn)周期及成本，確定優(yōu)化提取條件料液比為1∶12，提取2次，每次120 min。

圖1 料液比和提取次數(shù)對總生物堿含量的三維效應(yīng)面圖

圖2 料液比和提取時間對總生物堿含量的三維效應(yīng)面圖

圖3 提取次數(shù)和提取時間對總生物堿含量的三維效應(yīng)面圖

2.3.5 最優(yōu)制備工藝驗證 按照2.3.1 項下方法及優(yōu)化的工藝，以50%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶12，提取2次，每次120 min。制備3批野扇花顆粒，總生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.10 mg·g-1。以偏差作為所建模型預(yù)測性是否良好的指標(biāo)，按公式（1）計算，結(jié)果偏差值為5.78%，表明所建立的模型具有良好的預(yù)測性。

2.4 野扇花顆粒藥效學(xué)實驗

2.4.1 對小鼠應(yīng)激性胃潰瘍的影響 選取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，即對照組，模型組，雷尼替丁組（0.1 g·kg-1），野扇花顆粒高、中、低劑量組（6.0、3.0、1.5 g·kg-1），每組10只。每天灌胃給藥1 次，連續(xù)10 d，對照組、模型組給予等體積蒸餾水。小鼠禁食24 h 后進行末次給藥，給藥后1 h，除對照組外，將各組小鼠四肢固定于模板上，浸泡于22～25 ℃水中14 h。取出小鼠，處死，解剖，分別結(jié)扎胃幽門和賁門，每只小鼠胃內(nèi)注入10%甲醛溶液1 mL，固定10 min 后，體視顯微鏡下觀察胃部的潰瘍點數(shù)。和對照組比較，模型組小鼠潰瘍點數(shù)顯著增多，模型制模成功；和模型組比較，野扇花顆粒高劑量組可顯著降低應(yīng)激性胃潰瘍小鼠潰瘍點數(shù)。結(jié)果表明，野扇花顆粒具有抗胃潰瘍作用，結(jié)果見表4。

表4 野扇花顆粒對小鼠應(yīng)激性胃潰瘍的影響（,n=10）

表4 野扇花顆粒對小鼠應(yīng)激性胃潰瘍的影響（,n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4.2 對小鼠熱板痛閾的影響 選取健康昆明種小鼠，將預(yù)先經(jīng)篩選的雌性小鼠（除去反應(yīng)過敏<5 s及遲鈍>30 s 的小鼠）隨機分5 組，即對照組（等體積蒸餾水），陽性藥羅通定組（0.06 g·kg-1），野扇花顆粒高、中、低劑量組（6.0、3.0、1.5 g·kg-1）。先測出各組小鼠給藥前的痛閾值后，分別灌胃給藥，對照組給予蒸餾水，陽性組給予羅通定，野扇花組給予野扇花顆粒藥液，給藥7 d，末次給藥后60、90、120 min測定各小鼠痛閾值。和對照組比較，給藥后60 min，野扇花顆粒高劑量組可顯著延長小鼠熱刺激性疼痛的潛伏期。結(jié)果表明，野扇花顆粒具有鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果見表5。

表5 野扇花顆粒對小鼠熱板痛閾的影響（,n=10）

表5 野扇花顆粒對小鼠熱板痛閾的影響（,n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；表6同。

2.4.3 對醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的影響 選取健康昆明種小鼠50 只，雌雄各半，分組、給藥方式同2.4.2項下方法，連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，5 min 后記錄15 min 內(nèi)各鼠出現(xiàn)的扭體反應(yīng)次數(shù)。和對照組比較，野扇花顆粒高劑量組可顯著降低醋酸引起小鼠扭體次數(shù)。結(jié)果表明，野扇花顆粒具有鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果見表6。

表6 野扇花顆粒對醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的影響（,n=10）

表6 野扇花顆粒對醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的影響（,n=10）

3 討論

常用正交設(shè)計方法精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較差，因此，集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體的CCD 效應(yīng)面法被廣泛應(yīng)用[3-7]，通過水平因素與考察指標(biāo)之間線性或非線性關(guān)系描繪效應(yīng)面，進行方差分析，從擬合的效應(yīng)面上優(yōu)選效應(yīng)區(qū)域，提高了擬合的精度，從而使最優(yōu)條件下效應(yīng)面的預(yù)測值和實測值相近。效應(yīng)面法也存在水平因素過多時，實驗次數(shù)過多的不利之處，本研究先采用單因素考察對提取溶劑進行選擇，優(yōu)選了50%乙醇作為提取溶劑，然后按照效應(yīng)面設(shè)計表進行實驗，減少了實驗次數(shù)，同時控制了實驗的誤差。

野扇花是苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)常用于治療胃病、跌打損傷、頭暈心悸、喉嚨腫痛的中藥，富含清香桂堿、富貴草堿、表富貴草堿、海南野山花堿等甾體類生物堿[8-12]。研究表明，野扇花總生物堿有較好的抗?jié)儭⒔獐d、鎮(zhèn)靜、耐缺氧等藥理活性[13]，對胃腸道平滑肌有明顯的興奮作用[14]。野扇花顆粒劑的初步藥效學(xué)研究表明，其具有較好的抗?jié)儭㈡?zhèn)痛作用，為下一步將其開發(fā)成民族藥制劑提供了參考。