COL3A1在頭頸鱗癌中的表達研究①

何 超，張 雪， 劉 爽

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

頭頸鱗癌包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分，發病率較高的為口腔鱗癌、鼻咽癌、喉癌。超過90%的頭頸部腫瘤為鱗狀細胞癌。最近10年全球頭頸部鱗狀細胞癌的發病率明顯上升，全球每年約有645，000例新發生的頭頸部癌病例[1，2]。在大多數國家，頭頸部腫瘤男性多于女性，且年齡≥50歲者多見。頭頸鱗癌發病隱匿，且容易發生淋巴結轉移，手術后復發風險高，5年生存率不足50%[3]。TCGA數據庫是由美國國家癌癥研究所與美國國家人類基因組研究所合作建立的癌癥研究項目，匯總了癌癥相關的各種組學數據，是目前世界最大的癌癥研究參考數據庫。TCGA數據庫免費提供33種癌癥的DNA、RNA、miRNA測序結果以及SNP、甲基化測序等多維度數據，通過這些信息幫助各國研究者分析癌癥特異性表達的基因[4]。我們課題組使用GEPIA在線軟件對TCGA數據庫分析頭頸鱗癌特異性基因，并在細胞水平進行驗證，為頭頸鱗癌特異性生物標志物的尋找提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 數據獲取及差異分析

通過GEPIA在線軟件進行泛癌分析COL3A1在31種癌癥中表達差異，進而分析COL3A1在頭頸鱗癌人群與正常人群中表達水平，以及在頭頸鱗癌不同階段表達情況。

1.2 實驗材料

正常口腔成纖維細胞株hMOF,口腔鱗狀細胞癌細胞株KB與CAL-27,由口腔醫院關鍵教授惠贈。DMEM培養基，胎牛血清，TRIZOL試劑(購自碧云天生物公司)，反轉錄試劑MightyScript 第一鏈 cDNA 合成Master Mix，熒光定量SYBR-qPCR Kit擴增試劑盒(購自上海生工生物公司)。

1.3 細胞株中COL3A1表達水平檢測

1.3.1 細胞培養

37℃,5%CO2條件下培養細胞，收集指數生長期細胞，常規0.25%胰蛋白酶消化，計數，PBS洗滌離心，Trizol法提取總RNA。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測COL3A1

使用生工RNA反轉錄試劑盒合成cDNA。反應溫度為：25℃5min；42℃30min；85℃5min。按生工熒光定量PCR試劑盒(染料法)說明書推薦進行。COL3A1引物序列為：上游引物：5`-TCAGGCCAGTGGAAATGRAAAGA -3`,下游引物：5`-CACAGCCTTGCGTGTTCGATA -3`； TGF-β3引物序列為：上游引物：5`-CTCTACATTGACTTCCGACA -3`，下游引物：5`-GCAGATGCTTCAGGGTTC -3`。采用β-actin作為內參，引物序列為：上游引物：5`-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC -3`,下游引物：5-`ATGGAGCCACCGATCCACA -3`。反應體系：2Xmirna qPCR master mix 10μL；上下游引物各0.5μL；cDNA 2μL；ROX Reference Dye(H)1μL；RNase-free water 6μL；應用7300 real time PCR進行檢測。反應條件為：95℃150s；(95℃15s +60℃30s)進行40個循環；溶解曲線以7300 real time PCR儀推薦的程序自動設定。每份樣本均在同等條件下進行COL3A1的檢測，每個樣本進行3次重復。濃度相對水平進行對數( 2^-△△CT) 處理后，比較COL3A1基因的起始模板量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 COL3A1在泛癌中的表達水平

對于頭頸鱗癌，TCGA數據庫包含519例腫瘤患者與44名正常對照者的總RNA表達信息。使用GEPIA在線分析，得到COL3A1,COL5A1，COL5A2,COL1A1,COL1A2，ADAM12以及COL12A1等差異表達基因，其中COL3A1差異最顯著，以此為切入點，進行泛癌分析，發現在31種癌癥中，COL3A1在乳腺浸潤癌BRCA，食管癌ESCA,惡性膠質瘤GBM,頭頸鱗癌HNSC,胰腺癌PAAD,胸腺瘤THYM等13種癌癥中高表達并有統計學意義。見圖1。

圖1 COL3A1在不同癌癥與正常對照組織中表達

2.2 COL3A1在頭頸鱗癌中的表達水平

TCGA數據庫收集頭頸鱗癌患者519例，正常對照44例，通過RT-qPCR檢測mRNA水平，箱式圖及TPM圖可以明確COL3A1在頭頸鱗癌組織中高表達并且有統計學意義。見圖2。

圖2 COL3A1在頭頸鱗癌與正常對照組織中表達

在頭頸鱗癌發展的不同階段，可以看到COL3A1的表達水平的中位數變化不明顯，但變化范圍增加。見圖3。

圖3 COL3A1在頭頸鱗癌不同時期表達

2.3 COL3A1在頭頸鱗癌細胞株中的表達水平

從正常口腔成纖維細胞株hMOF與頭頸鱗癌細胞株KB，CAL中提取mRNA并反轉錄合成cDNA，通過染料法檢測COL3A1表達水平，RT-qPCR結果顯示，COL3A1在腫瘤細胞株中高表達，并且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 COL3A1及TGF-β1在頭頸鱗癌細胞株中表達

3 討論

頭頸鱗癌包含種類較多，發病情況復雜，口腔鱗癌是其中的代表性鱗癌，雖然其都屬于鱗狀細胞癌，但由于發病位置不同，發病機制也各不相同。目前頭頸部的鱗狀細胞癌主要以手術治療為主，雖然隨著醫療水平的不斷發展，治療手段不斷完善，但總體預后還是不容樂觀。腫瘤的微環境與腫瘤的發展遷移密切相關，細胞外基質中的成分與腫瘤的發生發展關系密切，在細胞基質中膠原蛋白超家族是主要組成部分，細胞外基質中膠原蛋白主要包括I型、II型、III型、V型膠原蛋白。COL3A1基因編碼的III型膠原蛋白，廣泛存在于細胞外基質，與細胞的增殖、分化與遷移/侵襲有密切關系，但在腫瘤的的發展遷移中的作用尚未有定論。有文獻報道，COL3A1的高表達形成的膠原蛋白具有一定屏障作用，可以抑制腫瘤細胞的遷移，也有文獻報道，COL3A1的高表達可以促進腫瘤的侵襲與遷移[5,6]。本文通過GEPIA在線分析發現在多種癌癥中COL3A1呈現高表達趨勢，并且在細胞水平驗證，在惡性程度較高的腫瘤細胞株中COL3A1表達明顯增加，與數據庫預測結果一致。本文同時也檢測了腫瘤相關的轉化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)家族中TGF-β3的表達水平。TGF-β3參與器官纖維化、創面愈合以及瘢痕形成等生理病理活動并發揮促細胞增殖，遷移及促進膠原蛋白合成及調控纖維化等作用。已經有文獻報道，TGF-β通過Smad2/3信號通路來實現對膠原合成調控，可以上調COL3A1基因的表達，促進III型膠原蛋白產生，在本實驗中也發現TGF-β3的表達與COL3A1表達趨勢相近，說明可能參與共同信號通路調控的生物反應。

綜上所述，COL3A1的高表達在腫瘤細胞株中具有潛在的診斷意義，但由于頭頸鱗癌的種類復雜，發病位置不同，涉及的組織則不同，轉移機制也有差異，本實驗沒有經過大量臨床樣本驗證，其作為生物標志物的臨床實用性有待進一步研究。