米曲霉和黑曲霉協(xié)同發(fā)酵杏仁粕風(fēng)味物質(zhì)的變化

零春甜，湯輝煌，周彩瑩，楊 晨，汪建明

(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

苦杏仁俗稱(chēng)山杏仁，是世界上最流行的堅(jiān)果之一[1].杏仁粕是杏仁油提取后的副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量豐富，占杏仁粕的50%以上.采用微生物發(fā)酵杏仁粕，不僅可以將蛋白質(zhì)降解為多肽和氨基酸等物質(zhì)，還可以產(chǎn)生具有杏仁粕曲料特征的風(fēng)味.黑曲霉是一種廣泛運(yùn)用于食品發(fā)酵的真菌，用來(lái)發(fā)酵杏仁粕不會(huì)產(chǎn)生真菌毒素，符合食品衛(wèi)生的要求[2].米曲霉是一種生長(zhǎng)快、酶系豐富、不產(chǎn)毒素的菌種，目前廣泛應(yīng)用于調(diào)味品的生產(chǎn)[3].

近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵改良食品風(fēng)味已有較多報(bào)道.周彩瑩等[4]在最佳工藝條件下用黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕，測(cè)得氨基態(tài)氮含量為1.92%時(shí)產(chǎn)生風(fēng)味的香氣濃郁.左勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵甜面醬的氨基態(tài)氮含量為13.78～16.6mg/g時(shí)，對(duì)鮮味有重要貢獻(xiàn).任利平等[6]利用發(fā)酵酶解法優(yōu)化干腌火腿風(fēng)味基料氨基態(tài)氮含量為2.25%，風(fēng)味評(píng)分最高.混菌發(fā)酵產(chǎn)生的酶系比單一菌種復(fù)雜，可顯著改良食品的風(fēng)味和口感.

因此，本文采用黑曲霉、米曲霉協(xié)同發(fā)酵杏仁粕，以氨基態(tài)氮含量和特征風(fēng)味強(qiáng)度為考察指標(biāo)，通過(guò)感官評(píng)價(jià)和儀器測(cè)定的方法，研究影響杏仁粕發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵因素，使杏仁粕在微生物發(fā)酵下有效風(fēng)味成分充分釋放，賦予杏仁粕豐滿(mǎn)的風(fēng)味，為杏仁粕制曲產(chǎn)肉味香精基料提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

杏仁粕，張家口永昌源果仁食品有限公司；黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)菌粉，山東康源生物技術(shù)有限公司.

甲醛、三氯乙酸(TCA)，分析純，天津市津科精細(xì)化工研究所；石油醚，分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠(chǎng)；硼酸，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng).

DW-86L386型超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；TDZ5-WS型低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；HFU586BASIC型立式超低溫冰箱，德國(guó)Thermo Scientific公司；Evolution300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Thermo Fisher Scientific 公司；LE438型pH電極，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Trace1300 ISQ型氣質(zhì)聯(lián)用儀，蘇州冷杉精密儀器有限公司.

1.2 制曲方法

材料預(yù)處理：杏仁粕經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎，80目過(guò)篩，密封備用.

制曲流程：取粉碎、過(guò)篩后的杏仁粕10g裝入三角瓶，120℃高壓蒸汽滅菌30min，降溫取出迅速打散，待溫度降至室溫，根據(jù)杏仁粕的質(zhì)量接種5%的混合菌粉(黑曲霉、米曲霉)，再加入適量水，混合均勻.30℃恒溫培養(yǎng)5d，當(dāng)瓶?jī)?nèi)布滿(mǎn)菌絲且菌絲聯(lián)結(jié)基質(zhì)成塊后翻曲，最后出曲.

1.3 測(cè)定方法

揮發(fā)物含量測(cè)定：參考GB/T 14489.1—2008《油料水分及揮發(fā)物含量測(cè)定》方法；氨基態(tài)氮的測(cè)定：采用甲醛滴定法，參考ZB X 66038—1987《氨基態(tài)氮測(cè)定法》.

曲料風(fēng)味強(qiáng)度的評(píng)定：具體方法參照文獻(xiàn)[7]高溫大曲質(zhì)量的評(píng)分，風(fēng)味強(qiáng)度＝外觀(guān)＋皮厚＋斷面＋香氣.在前人研究方法的基礎(chǔ)上，選擇外觀(guān)、皮厚、斷面、香氣等感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1.篩選14名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的小組成員(男7名，女7名，年齡23～48歲)進(jìn)行描述性感官評(píng)價(jià)分析.

表1 曲料質(zhì)量評(píng)分指標(biāo)Tab. 1 Standards for evaluation of koji quality

頂空固相微萃取(HS-SPME)：準(zhǔn)確稱(chēng)取5g樣品于20mL的樣品瓶中，(60±0.5)℃水浴恒溫平衡15min，將三相萃取頭插入樣品瓶中頂空萃取40min后取出萃取頭，再插入GC-MS進(jìn)樣口解析15min，檢測(cè)其揮發(fā)性組分.色譜條件：色譜柱為T(mén)R-5MS型石英毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；初始溫度40℃，保持3min，以4℃/min升到150℃保持4min；載氣為高純氮?dú)?，不分流模式，流量?mL/min.質(zhì)譜條件：連接口溫度250℃，EI離子源，電子能量70eV，離子源溫度300℃，質(zhì)譜掃描范圍(m/z)50～300.

1.4 杏仁粕曲料風(fēng)味的影響因素優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

菌種比對(duì)曲料風(fēng)味的影響：按照米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)為1﹕0、0﹕1、2﹕1、3﹕1、4﹕1進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37℃，水料比(mL﹕g)為1﹕1.以氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度為指標(biāo)確定適宜菌種比.

水料比對(duì)曲料風(fēng)味的影響：在上述確定的適宜菌種比的基礎(chǔ)上，按照水料比(mL：g)為0.2﹕1、0.4﹕1、0.6﹕1、0.8﹕1、1.0﹕1進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37℃.以氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度為指標(biāo)確定適宜水料比.

發(fā)酵溫度對(duì)曲料風(fēng)味的影響：在上述確定的適宜菌種比和水料比的基礎(chǔ)上，按照25、30、35、40、45℃的發(fā)酵溫度進(jìn)行發(fā)酵，以氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度為指標(biāo)確定適宜發(fā)酵溫度.

1.4.2 響應(yīng)面分析

以菌種比、水料比、發(fā)酵溫度3個(gè)因素的不同設(shè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定曲料中的物質(zhì)風(fēng)味強(qiáng)度和氨基態(tài)氮含量.在單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳工藝參數(shù).

1.5 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin9軟件分析，Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 10.0.7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)曲料風(fēng)味的影響

杏仁粕發(fā)酵過(guò)程菌種比、水料比、發(fā)酵溫度對(duì)曲料風(fēng)味的影響如圖1所示，其中不同字母表示組間有顯著差異.

圖1 培曲菌種比、水料比、發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度的影響Fig. 1 Effects of culture strains ratios，waters-material ratios and temperature on amino acid nitrogen and sensory properties

菌種比決定菌種在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)繁殖速度，并直接決定發(fā)酵產(chǎn)物種類(lèi)和含量[7].由圖1(a)可知：曲料中氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)相似，成曲的氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度隨著黑曲霉的增加而減少，表明成曲中酸性蛋白酶活力較少，中性蛋白酶活力較高.氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度隨米曲霉的增加而增加.在米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比為3﹕1時(shí)，氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度都達(dá)到最大值，表明中性蛋白酶活力較強(qiáng)[8].當(dāng)米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比為4﹕1時(shí)，氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度都出現(xiàn)下降，可能是菌株分泌的酶下降導(dǎo)致.因此，初步確定米曲霉和黑曲霉的適宜質(zhì)量比為3﹕1.

曲料水分與氨基態(tài)氮含量有重要關(guān)系.水分過(guò)多時(shí)，不利于各種酶類(lèi)的代謝反應(yīng)，造成曲料過(guò)稀，對(duì)于酶活力有一定的影響.由圖1(b)可知：不同的水料比對(duì)氨基態(tài)氮的含量有影響，隨著水分的增加，曲料中的氨基態(tài)氮含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì).水料比(mL﹕g)為0.2﹕1～0.4﹕1時(shí)，由于水分含量適宜，適合蛋白酶活性，將蛋白質(zhì)分解成游離氨基酸，使氨基態(tài)氮含量增加，風(fēng)味強(qiáng)度也隨之逐漸增加[9].水料比為0.4﹕1時(shí)，曲料中的氨基態(tài)氮含量最高為1.197%，水料比超過(guò)0.4﹕1時(shí)，由于水分活度大，對(duì)蛋白酶起到抑制作用，蛋白酶分解蛋白的能力降低，使得曲料中氨基態(tài)氮含量逐漸減少.當(dāng)水料比超過(guò)0.6﹕1時(shí)，曲料中氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度均隨著水分的增加而下降，原因是微生物的生長(zhǎng)需要適宜的水分，過(guò)多或過(guò)少的水分均會(huì)影響其生長(zhǎng)繁殖，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生影響[10]，水分的稀釋作用也會(huì)對(duì)滋味和香氣造成不利影響[11].因此，初步確定水料比的適宜比例(mL﹕g)為0.4﹕1.

發(fā)酵溫度通過(guò)改變微生物的蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)而影響微生物的代謝產(chǎn)物的生成種類(lèi)和生長(zhǎng)情況[12].由圖1(c)可知：在制曲過(guò)程中，氨基態(tài)氮含量隨著溫度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì).當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到30℃時(shí)氨基態(tài)氮含量達(dá)到最高，并顯著高于其他組(P＜0.05)；從30℃升高到45℃的過(guò)程中，氨基態(tài)氮含量直線(xiàn)下降，這可能是由于溫度高于30℃抑制了菌種發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶活性[13].相反，風(fēng)味強(qiáng)度隨著溫度的升高而逐漸升高，這可能是由于溫度越高，杏仁粕發(fā)生美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物越多，香氣越厚重，風(fēng)味強(qiáng)度越高.當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，氨基態(tài)氮含量下降，不利于風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，因此初步確定適宜發(fā)酵溫度為30℃.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(A)、溫度(B)、水料比(C)為因素，曲料的氨基態(tài)氮含量(Y1)和風(fēng)味強(qiáng)度(Y2)為響應(yīng)值進(jìn)行制曲優(yōu)化實(shí)驗(yàn).響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2.氨基態(tài)氮含量響應(yīng)面模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab. 2 Box-Behnken design and results

表3 氨基態(tài)氮含量的響應(yīng)面方差分析Tab. 3 Analysis of variance of response surface of amino acid nitrogen

從表3中可以看出，模型的F值為19.79，P＞F小于0.05，說(shuō)明總體該模型顯著.該模型失擬項(xiàng)的P＞F為0.86，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型選擇合適，可以用于氨基態(tài)氮含量變化的分析.

顯著影響因素對(duì)氨基態(tài)氮含量的交互作用如圖2所示.菌種比和溫度、溫度和水料比之間存在顯著的交互作用(P＜0.05)，與方差分析的結(jié)果一致.利用Design-Expert 10.0.7 分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到氨基態(tài)氮含量的二次回歸方程為

圖2 顯著影響因素對(duì)氨基態(tài)氮含量的交互作用Fig. 2 Interaction of significant influencing factors on amino nitrogen content

風(fēng)味強(qiáng)度響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 風(fēng)味強(qiáng)度的響應(yīng)面方差分析Tab. 4 Analysis of variance for response surface of sensory properties

從表4中可以看出：模型的F值為15.56、“P＞F”小于0.05，說(shuō)明總體該模型顯著.該模型失擬項(xiàng)的“P＞F”為0.85，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型選擇合適，可以用于風(fēng)味強(qiáng)度變化的分析.

顯著影響因素對(duì)風(fēng)味強(qiáng)度的交互作用如圖3所示.從圖3中可以看出，菌種比與溫度之間存在顯著的交互作用(P＜0.05)，與方差分析的結(jié)果一致.

圖3 顯著影響因素對(duì)風(fēng)味強(qiáng)度的交互作用Fig. 3 Interaction of significant factors on flavor intensity

用Design-Expert 10.0.7分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到風(fēng)味強(qiáng)度的二次回歸方程為

Y2＝81.6－0.25A－3.38B＋9.63C－5.50AB＋1.50AC－0.75BC－5.18A2－5.93B2－2.43C2加權(quán)綜合評(píng)分(Y)算法參考文獻(xiàn)[14].本實(shí)驗(yàn)中曲料的氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度對(duì)曲料的風(fēng)味同樣重要，所以加權(quán)系數(shù)均定為0.5.

Y＝0.5Y1＋0.5Y2

即

Y＝41.35-0.06A-1.76B＋5.01C-2.83AB＋0.78AC-0.45BC-2.69A2-3.01B2-1.34C2

2.3 最佳工藝條件

綜合以上對(duì)氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度的響應(yīng)面模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，以加權(quán)綜合評(píng)分最大化為指標(biāo)，得到發(fā)酵的最優(yōu)條件為米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)0.375﹕0.125、溫度30℃、水料比(mL﹕g)為0.5﹕1.此條件下發(fā)酵5d成曲的加權(quán)綜合評(píng)分為43.10，氨基態(tài)氮含量為0.95%，風(fēng)味強(qiáng)度為75.20.考慮到實(shí)際操作情況，將各條件修正為米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)3﹕1、溫度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1.在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，氨基態(tài)氮含量為1.25%，風(fēng)味強(qiáng)度為80.00，加權(quán)綜合評(píng)分為40.61，與預(yù)測(cè)值接近.這說(shuō)明該模型很好地預(yù)測(cè)了曲料的氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度，優(yōu)化工藝條件可靠.

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

杏仁粕發(fā)酵前后鑒定香氣物質(zhì)見(jiàn)表5.

共檢測(cè)了22種主要成分，其中酯類(lèi)3種、醛類(lèi)5種、醇類(lèi)5種、酮類(lèi)1種、酸類(lèi)2種、酚類(lèi)2種、含氮化合物3種、雜環(huán)化合物1種.曲料風(fēng)味物質(zhì)主要為苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯，其中醛類(lèi)和酮類(lèi)是含羰基化合物，是肉香的特征物質(zhì).醇類(lèi)化合物主要是脂質(zhì)的氧化降解或者是羰基化合物還原生成，主要具有花香、甜香和水果香.酯類(lèi)化合物可以通過(guò)醇和有機(jī)酸酯化反應(yīng)生產(chǎn)，一般賦予食品花香和果香.雜環(huán)化合物具有焦香味，可以使食物呈現(xiàn)烤肉香味[15].發(fā)酵后的醇類(lèi)和酯類(lèi)酸類(lèi)總量均高于發(fā)酵前的杏仁粕，這與文獻(xiàn)[16]研究結(jié)果一致，特別是發(fā)酵后總的醇類(lèi)含量是未發(fā)酵的總醇類(lèi)含量的6倍，是曲料產(chǎn)香的主體成分，也是形成酯類(lèi)物質(zhì)的前體，這使得曲料的風(fēng)味大大增加[17].適量的酸也可以提高曲料的整體協(xié)調(diào)性[18].曲料生產(chǎn)的過(guò)程中，由于溫度升高，曲料中的蛋白質(zhì)和微生物殘?bào)w自溶，轉(zhuǎn)化為氨基酸等物質(zhì)產(chǎn)生曲香[19].風(fēng)味物質(zhì)的差異是造成原樣和曲料感官特征不同的主要原因.

3 結(jié) 語(yǔ)

以杏仁粕為制曲基質(zhì)，對(duì)曲料中氨基態(tài)氮含量和風(fēng)味強(qiáng)度的影響因素進(jìn)行分析.結(jié)果表明，菌種比、水料比和發(fā)酵溫度對(duì)杏仁粕曲料的風(fēng)味都有影響，其影響程度由大到小依次為溫度、水料比、米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比.當(dāng)米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)3﹕1、溫度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1，發(fā)酵5d成曲的氨基態(tài)氮含量為1.25%、風(fēng)味強(qiáng)度為80.00，杏仁粕曲料風(fēng)味較好.對(duì)曲料進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，曲料風(fēng)味物質(zhì)主要為苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯.與未發(fā)酵相比，發(fā)酵的杏仁粕顏色加深、風(fēng)味加強(qiáng)，這為進(jìn)一步研究發(fā)酵杏仁粕曲料風(fēng)味，提高其應(yīng)用價(jià)值奠定了基礎(chǔ).