電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法測定人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子復合物凍干注射劑中的21種元素

姜樹銀，張迅杰，張乃斌，李春煥，賀美蓮，石峰，咸瑞卿

(山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東 濟南 250101)

血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)是由血管內皮細胞和骨髓巨核細胞合成的一種多結構域、多功能糖蛋白，在1期和2期止血中發揮重要作用[1-2]。人凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ)是一種血漿糖蛋白，是內源性凝血途徑中一種重要的凝血因子[3-6]。這兩種因子均為人體內重要的凝血成分，一旦缺乏會引起不同程度的血友病，嚴重時會危及生命。人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子復合物凍干注射劑是目前此類疾病的最有效的治療藥物。該藥物的生產工藝涉及沉淀、離心、吸附、層析、超濾、滅活等工序，所用儀器設備及物料均有可能引入重金屬，監測該制劑中重金屬元素的含量對于保證用藥安全非常重要。目前，采用微波消解-電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法測定藥品中金屬元素的方法較為成熟[7-9]，但尚無關于該產品中重金屬元素檢測方法的研究報道。本研究建立了ICP-MS測定人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子復合物凍干注射劑中21種常見金屬元素含量的方法，為該制劑的質量控制提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 7800型電感耦合等離子體質譜儀(Agilent公司)；MARS 6型微波消解儀(美國CEM Corporation公司)；EHD-40趕酸爐(北京東航科技有限公司)；A10純水機(美國Millipore)；XSE205型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 主要試劑 單元素硼(B)、鈧(Sc)、鎂(Mg)、鋁(Al)、硅(Si)、釩(V)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鍶(Sr)、鋯(Zr)、鉬(Mo)、銠(Rh)、鈀(Pd)、錫(Sn)、鋇(Ba)、鈰(Ce)、鉛(Pb)標準溶液(1 000 μg·L-1，Inorganic)；鎘(Cr，1 000 μg·L-1，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)；硝酸(65%，UP級,蘇州晶瑞化學股份有限公司)；超純水(純化水經A10純水機過濾，電阻率<18 MΩ·cm。

1.3 樣品 樣品由山東泰邦生物制品有限公司提供，批號：202012S08、202012S09、202012S10。

2 方法與結果

2.1 儀器工作參數

2.1.1 ICP-MS條件 等離子體選擇常規模式；功率為1 550 W，采樣深度為10.0 mm，等離子氣、霧化氣、輔助氣流量分別為15.0、0.99、0.9 L·min-1，He氣流量為3.7 L·min-1，泵速為0.10 r·s-1，霧化室溫度為2 ℃，積分時間為0.1 s，數據采集重復讀取3次，掃描/重復次數為100，峰型為3，穩定時間為40 s；硼(B)元素采用No Gas調諧模式，其他元素采用He調諧模式，有效消除來自質譜的干擾。

2.1.2 微波消解程序 依據消解罐的數量，選擇合適的功率。8～12罐：800 W,13～24罐：1 200 W,25～40罐：1 600 W。本研究選擇1 200 W，升溫程序：10 min內升溫至120 ℃，保持2 min；5 min內升溫至150 ℃，保持5 min，5 min內升溫至190 ℃，保持20 min。

2.2 溶液制備

2.2.1 內標溶液 選擇Sc(45)作為B(11)、Mg(24)、Al(27)、Si(28)、V(51)、Mn(55)、Fe(56)、Co(59)元素的內標；Ge(72)作為Ni(60)、Cu(63)、Zn(66)、Sr(88)、Zr(90)、Mo(95)元素的內標；In(115)作為Rh(103)、Pd(105)、Sn(118)、Ba(137)元素的內標；Bi(209)作為Pb(208)元素的內標。精密量取內標單元素標準溶液(1 000 μg·L-1)適量，用2%硝酸稀釋至200 mL，使Sc(45)、Ge(72)、In(115)元素濃度為300 μg·L-1、Bi(209)元素濃度為100 μg·L-1。使用蠕動泵和T型混合三通在線添加，對分析信號進行校正，有效地克服信號漂移、消除一定的基體干擾。

2.2.2 混合標準元素線性溶液 精密量取21種單元素標準溶液(1 000 μg·mL-1)適量(見“1.2”項下主要試劑)，用2%硝酸溶液稀釋至50 mL，作為混合標準元素線性溶液(1)～(7)，其濃度范圍見表1。

2.2.3 供試品溶液和空白溶液 精密稱取本品約0.5 g，置微波消化罐中，加入2 mL水，使潤濕，加入8 mL硝酸，密封，浸泡過夜。置微波消解儀中，按“2.1.2”項下微波消解程序消解。冷卻后取出，置趕酸爐中，130 ℃下趕酸至紅棕色蒸汽揮盡后，繼續濃縮至剩余溶液約為0.5 mL，放冷，用水轉移并定容至25 mL離心管中，搖勻，即得。不加樣品，同法制備空白溶液。

2.3 測定法

2.3.1 線性關系和線性范圍 取“2.2.2”項下混合標準元素線性溶液，按“2.1.1”項下ICP-MS 條件進樣測定，記錄儀器相應值。以待測元素濃度為橫坐標，待測元素響應值(CPS值)與內標元素響應值(CPS值)的比率為縱坐標，進行線性回歸(儀器自動計算)。結果見表1。

表1 混合標準元素線性溶液濃度、范圍、回歸方程(μg·L-1)

2.3.2 檢出限(LOD)與定量限(LOQ) 取2%硝酸溶液，連續進樣11次，計算待測元素CPS值與內標CPS值比率的標準偏差SD，以3倍的標準偏差與線性方程中斜率的比值為檢出限，以10倍的標準偏差與線性方程中斜率的比值為定量限，結果見表2。

表2 檢出限與定量限結果(μg·L-1)

2.3.3 精密度 取混合標準元素線性溶液(4)，重復進樣6次，計算檢測值的RSD(%)，結果見表3。

表3 精密度結果(μg·L-1)

2.3.4 回收率 照第“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法，同時加入適量濃度的單元素標準溶液，平行制備6份，進樣檢測，計算回收率(%)和RSD(%)，結果見表4。

表4 回收率結果(%)

2.3.5 重復性 照第“2.3.4”項下回收率中供試品溶液的制備方法，平行制備6份，計算回收率(%)和RSD(%)，結果見表5。

表5 重復性結果(%)

2.3.6 樣品檢測結果 取本品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣檢測，計算樣品中各元素的含量。結果見表6。表6中S08-3、S09-3、S10-3和S08-6、S09-6、S10-6為本品202012S08、202012S09、202012S10按加速試驗條件[(40±2)℃，75%±5%]存放3個月和6個月的檢測結果。

表6 樣品中各元素含量檢測結果(μg·L-1)

3 討論

《中國藥典》2020年版人血白蛋白鋁殘留量測定法第二法收載了ICP-MS法。參照此法，采用5%硝酸沉淀蛋白4 h后，離心濾過，上樣測定，結果顯示基質干擾大，結果重現性差。研究發現，該方法蛋白沉淀不完全，易帶來較大儀器污染導致測定結果出現較大波動。本研究采用微波消解法，通過優化樣品取樣量、消解液用量、消解時間、消解溫度等參數，建立了適用的樣品前處理方法，采用該方法樣品消解完全，溶液澄清，降低了酸對采樣錐的損壞，并消除其他試劑引入帶來的基體干擾，測定結果重現性良好。該方法快速簡便、靈敏度高、準確性好，不僅適用于人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子復合物凍干注射劑中金屬元素的檢測，而且可為其他血液制品中金屬元素含量的測定提供參考。