腫瘤相關蛋白分子核轉運機制研究進展

張藝新，戴蓓英，楊勇，陳真

(1.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198；3.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，江蘇 南京 211198)

細胞的生命活動基于錯綜復雜的信號傳導，其中多種信號分子的傳導依賴于正常運轉的核轉運系統(nuclear transport system，NTS)，如轉錄因子入核調控下游靶基因的表達以及靶基因產物出核發揮功能等。研究表明，核轉運異常會導致某些信號通路的持續激活或抑制，進而導致包括腫瘤在內的多種疾病的發生。腫瘤的發生和發展常與多種信號蛋白異常的亞細胞定位相關，闡明信號蛋白的核轉運機制對于研究腫瘤發生發展過程至關重要。

1 核轉運系統的組成以及核轉運機制

核轉運系統主要由核孔復合體(nuclear pore complex，NPC)和核轉運受體(nuclear transport receptors，NTR)組成，可允許分子量大于40 kDa的大分子物質進行選擇性的核-質交換。NPC是鑲嵌在核膜上的一種運輸通道，由30多種核孔蛋白(nucleoporins，NUP)分別構成胞質纖絲、胞質環、核質環、核籃等NPC亞結構[1]。約三分之一的NUPs都含有苯丙氨酸-甘氨酸(phenylalanine-glycine，FG)重復域，該結構域可延伸至核孔的中央通道，用于構建選擇性相關的網狀結構[1-2]。NTR主要由核蛋白-β(karyopherin-β)超家族組成，其中10個參與核輸入如importins，7個參與核輸出如exportins，2個參與雙向轉運，以及1個尚未鑒定的蛋白[3-4]。

通常，importin-α可識別貨物蛋白的核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)并與之結合，然后與importin-β結合形成“NLS/importin-α/importin-β”三聚體[5]。此外，importin-β也可直接與NLS序列結合，而不依賴于importin-α。在這兩種情況下，importins和貨物蛋白復合體均可與NUP的FG重復域結合并通過NPC進入核內，然后與Ran-GTP[Ran(ras-related nuclear protein)in complex with GTP]結合，從而使貨物蛋白與importins解離，隨后importins可與Ran結合，通過其特定的核輸出受體exportin-2重新穿梭至胞質內[6]，以進行下一次的核轉運。值得注意的是，有些蛋白可直接與NUP結合并轉運至核內，而不依賴于NTR，如β-catenin、SMADs等[7]。在出核轉運過程中，貨物蛋白可通過其核輸出序列(nuclear export sequence，NES)與exportins和Ran-GTP在核內形成三聚體，通過擴散作用出核。到達胞質后，GTP被水解成GDP，貨物蛋白被釋放至胞質內[5,8]。

2 腫瘤相關信號分子的核轉運機制

2.1 p53信號通路 p53是一種腫瘤抑制蛋白，可通過調控細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復等避免癌變的發生，因此其被稱為“基因組守護者”。臨床上約50%的腫瘤患者都存在p53的突變[9]。p53中NLS的泛素化可阻礙其與importin-α3結合，并抑制其向核內轉運，滯留在胞質內的p53可被蛋白酶體降解，使得p53維持在較低的表達水平。在DNA損傷、癌基因異常激活等應激條件下，p53泛素化水平降低，從而導致其NLS與importin-α3結合[10]，促進p53向核內轉運，入核的p53可形成四聚體，使其NES被包裹在內，并導致其不能與exportin-1結合而被滯留在核內[11]，從而持續激活下游信號通路。綜上，早期importin-α3介導的p53主動轉運增強以及后期exportin-1介導的p53核輸出受阻均與DNA損傷、癌基因異常激活等應激反應相關[12]。此外p53/MDM2調節因子RYBP的亞細胞定位對于p53功能的發揮十分重要[13]。Tan等[13]的研究表明，野生型RYBP主要定位于核內，將其NLS進行突變后，RYBP則主要定位于胞質內。胞質定位的RYBP突變體可顯著抑制MDM2介導的p53泛素化，從而抑制p53的降解并促使其向核內轉運。因此，相比于野生型RYBP，定位于胞質的RYBP突變體可顯著抑制細胞增殖并誘導其凋亡，這將為臨床腫瘤的治療提供新的思路[13]。

核轉運復合體除了可以介導p53的核轉運之外，還參與調控p53靶基因的表達，但這種功能不依賴于核轉運過程。例如exportin-2可以與p53靶基因(如TP53-AIP)的啟動子結合，從而誘導其表達[14]。此外，靶向RNAi篩選結果顯示，NUP98可通過與p21[15](CDKN1A，p53下游的細胞周期調控因子[16])mRNA的3′UTR區結合，從而在轉錄后水平調節p21的表達，避免p21被外泌體降解。p21在腫瘤生物學方面具有復雜的作用，既可抑制腫瘤的生長，但是在p53缺失的情況下又能促進腫瘤細胞的增殖。其復雜的生物學功能與多種決定因素相關，其中就包括p21的亞細胞定位[17-18]。作為p53的下游靶基因，核內的p21通過其對細胞周期的調控作用抑制腫瘤細胞的增殖[17-19]，但是胞質內的p21可通過抑制pro-caspase 3、caspase 8,以及caspase 10發揮抗凋亡作用，因此胞質內的p21具有致癌性并可導致較差的預后[17-19]。Exportin-1可介導p21的核輸出[20]，因此exportin-1的過表達可促進p21在胞質中的積累，從而發揮其促癌作用。

2.2 WNT/β-catenin信號通路CTNNB1外顯子3的錯義突變常會導致WNT級聯信號的異常激活。在這一過程中，β-catenin在核內積聚，并與淋巴增強因子(LEF)/T細胞因子(TCF)相互作用，驅動MYC、CCND1等促癌基因的表達[21-22]，從而促進肝癌的發生。由于β-catenin不含有NLS，因此其核轉運不依賴于NTR和Ran-GTP[7]，而是通過直接與NUP62、NUP98、NUP153、NUP358結合并向核內轉運[23]。截短體實驗表明，β-catenin通過其C端以及ARM重復序列(Armadillo repeats)與NUP結合被轉運至核內[24]，同樣該區域可與Ran-BP3結合介導β-catenin的出核轉運[24-25]。盡管Ran-BP3是exportin-1的輔助因子，但是β-catenin的核輸出并不依賴于exportin-1[25]。綜上所述，β-catenin的入核和出核轉運均不依賴于NTR。

2.3 NF-κB信號通路 NF-κB信號通路在炎癥和免疫反應中發揮重要作用，并且與炎癥相關型腫瘤的發生和發展密切相關。NF-κB作為轉錄因子可激活下游靶基因從而調控細胞增殖、凋亡、分化、應激和免疫應答等細胞活動[26]。NF-κB是由p50、p52、p65(RELA)、c-REL、RELB 5種亞基兩兩組合形成的二聚體，多數情況下是由p50和p65組成異二聚體[26]。IκBs(如IκBα、IκBβ)是NF-κB的抑制劑，其通過與NF-κB結合從而阻礙NF-κB的NLS序列與NTR結合，從而將NF-κB阻滯在胞質內[27]。當細胞受胞外信號刺激后，IκB激酶復合體使IκB磷酸化，隨后導致其泛素化并被蛋白酶體降解，從而暴露NF-κB的NLS，隨后NF-κB可迅速被轉運至核內，誘導相關基因的表達[27]。

TNF-α可誘導NF-κB(p50/p65)向核內轉運[27]，該轉運過程由importin-α3以及importin-α4介導。此外，NF-κB亞基與importin-α的結合具有特異性，如p52可直接與importin-α3、importin-α4、importin-α5、importin-α6結合；c-REL可與importin-α5、importin-α6、importin-α7結合；RELB可與importin-α5、importin-α6結合[27]。值得注意的是，NF-κB二聚體與importin-α結合的特異性僅取決于其中一個亞基，如RELB介導p52/RELB二聚體與importin-α的結合，p52則介導p52/p65二聚體與importin-α的結合[28]。NF-κB不僅可與NTR結合，同時還可與NUP88相互作用。過表達的NUP88可抑制NF-κB的核輸出，從而導致其在核內積聚[29-31]。

2.4 Ras/MAPK和PI3K/AKT信號通路 受體酪氨酸激酶(RTK)如胰島素樣生長因子受體(IGF-R1)，可通過Ras/Raf/MEK/ERK信號通路促進細胞增殖和存活，亦可通過PI3K/AKT信號通路促進蛋白質的合成以及葡萄糖代謝，最終發揮促腫瘤作用[32]。細胞外信號調節激酶(ERK1/2)的亞細胞定位對于Ras/Raf/MEK/ERK激酶級聯反應至關重要。在生理條件下，MEK1/2可將ERK1/2錨定在細胞質中[33]。當接受外界刺激后，MEK1/2對于ERK1/2的磷酸化修飾導致其構象發生改變并與MEK1/2亞基分離，隨后importin-7識別ERK1/2激酶插入區中磷酸化的SPS(Ser-Pro-Ser)基序[34]，從而將ERK1/2轉運至核內而不依賴于importin-α。也有研究證明ERK2可通過NTR依賴的方式入核[35-36]，其核輸出依賴于exportin-1[37]。胞質內Ca2+濃度也可影響ERK2的亞細胞定位，高濃度的Ca2+可增加ERK2與NUP153的結合，使ERK2滯留在核膜上從而抑制其向核內轉運[38]。

在PI3K/AKT信號通路中，磷酸化的AKT可抑制TSC1和TSC2，從而激活mTORC1。激活的mTORC1對真核細胞翻譯起始因子(eIF4E)結合蛋白(4E-BPs)進行磷酸化修飾，使其與eIF4E分離。游離的eIF4E可使NPC胞質側的成分發生重排，從而促進eIF4E下游靶基因mRNA(如CyclinD1、c-MYC、MDM2)向胞質內轉運并翻譯成蛋白質[39-40]。有研究表明，在上述過程中，eIF4E可促進Ran-BP1以及DDX19的表達，抑制NUP358/Ran-BP2表達，并能使NUP214重新定位。相反，NUP358/Ran-BP2過表達可抑制eIF4E靶基因mRna的核輸出，從而阻止腫瘤惡化[40]。

2.5 JAK/STAT信號通路 JAK/STAT信號通路可介導多種細胞因子，如表皮生長因子(EGF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)、干擾素(INF)等的信號傳導，從而參與調節細胞增殖、分化、免疫等重要的生物學過程。JAK/STAT信號通路在多種血液瘤和實體瘤中均處于持續激活狀態[41]。當上述細胞因子與胞膜上相應的受體結合時，后者形成二聚體，從而激活胞內的酪氨酸激酶(JAK)。活化的JAK可使轉錄因子STAT磷酸化并形成二聚體，隨后被轉運至核內，從而調節下游靶基因的表達。

STAT1和STAT3可以較高的親和力直接與importin-α5結合[42]，同時STAT3與importin-α7也存在較弱的相互作用，而STAT5a以及STAT5b則不與importin-α結合[43]。Riku等[42]的研究表明，STAT1與importin-α5的結合依賴于STAT1 DNA結合域中410～413位的氨基酸。STAT3與importin-α5的結合則依賴于STAT3中214和215位的精氨酸，其414和417位的精氨酸雖不直接參與STAT3與importin-α5的結合，但對于維持STAT3二聚體的構象至關重要[43]。

在出核轉運方面，STAT1中400～409位氨基酸，以及其卷曲螺旋結構域中302～314位的氨基酸均可充當NES與exportin-1結合，從而促進STAT1向胞質內轉運[42,44]。值得注意的是STAT1 400～409位的NES與其410～413位的NLS相鄰，因此STAT1中NES的突變不僅能影響其與exportin-1的結合，同時也可能干擾其NLS與importin-α5的相互結合[42]。

2.6 TGF-β信號通路 TGF-β超家族配體與TGF-β受體Ⅱ結合，后者可催化Ⅰ型受體的絲氨酸殘基磷酸化并使其活化，活化的Ⅰ型受體可使SMAD蛋白磷酸化并轉運至核內，從而與核內的其他輔因子一起調節靶基因的轉錄[45]。由于TGF-β信號通路通常會抑制細胞的生長，因此該通路的失活可促進腫瘤的發生和發展[45]。此外，TGF-β受體和SMAD蛋白的突變在腫瘤中均有報道[45]。

TGF-β誘導的SMAD2、3磷酸化可降低其與SARA(定位于細胞質的SMAD保留因子)的結合，從而促使其向核內轉運[46]，但是SMAD2、3的入核轉運并不依賴于該磷酸化過程[46]。SMAD2、3的MH2結構域含有3個疏水口袋，該疏水口袋可與CAN/NUP214、NUP153的FG重復域結合，從而促進SMAD2、3的入核轉運[46]。雖然SMAD2的核轉運不依賴于NTR，但是importin-β可通過與CAN/Nup214的競爭性結合抑制SMAD2向核內轉運[47]。磷酸酶PPM1A可將p-SMAD2、3去磷酸化，以促進RanBP3與SMAD2、3的結合，從而促進SMAD2、3的出核轉運[48]。

SMAD蛋白家族包括R-SMAD、Co-SMA、I-SMAD 3個亞家族，分別為SMAD1-9[49]。與SMAD2、3相似，SMAD4的入核轉運同樣不依賴于NTR，是由CAN/NUP214以及NUP153介導的，但是該過程不受SARA的影響[46]。SMAD4的出核轉運依賴于exportin-1。磷酸化的SMAD2、3或其他轉錄輔助因子可通過與SMAD4結合，從而干擾SMAD4與exportin-1的相互作用，導致SMAD4在細胞核中積聚[46]。

2.7 人端粒酶催化亞基(hTERT) 端粒是真核染色體末端的核蛋白復合物，對于維持染色體的完整性至關重要。高度保守的端粒DNA在每次復制后都會縮短，當端粒縮短至一定程度，細胞則停止分裂。因此，端粒的長短和穩定性決定了細胞的壽命，并與細胞的衰老和癌變密切相關[50]。染色體末端端粒重復序列的從頭合成需要端粒酶的催化，該酶在成人體細胞中不表達，但腫瘤細胞可通過激活端粒酶的表達來躲避“端粒危機”，從而獲得永生化。

腫瘤細胞內端粒酶的活化依賴于人端粒酶催化亞基(hTERT)的入核轉運。有研究表明，在hTERT的222～224位以及236～240位的氨基酸可作為其NLS，同時，這兩個NLS之間的227位絲氨酸的磷酸化對于hTERT的入核轉運也是必需的[51]。NLS的磷酸化可導致hTERT構象改變并暴露其NLS[51-52]，后者可與importin-α1、3、5以及importin-β結合，并以Ran依賴的方式將hTERT轉運至核內[51]。其次，hTERT磷酸化導致的構象轉換也可能暴露其與其他因子結合的位點，例如，AKT激酶對hTERT的磷酸化可促進hTERT與NF-κB p65亞基的結合，二者結合后可迅速轉移至核內，從而激活端粒酶并使端粒得到延長[53]。

hTERT 970-981位的NES通過與exportin-1結合從而將hTERT轉運至胞質內[54]。有研究表明，14-3-3蛋白可通過其C端與hTERT的C端結合，抑制hTERT的NES與exportin-1的結合，從而抑制hTERT向核外轉運[54]。

2.8 JNK/c-Jun信號通路 JNK可被多種細胞因子(如腫瘤壞死因子α、白介素-1、表皮生長因子)、應激條件(如氧化損傷，電離輻射)等多種因素激活并轉運至核內，核內的JNK可調節包括c-Jun在內的多種轉錄因子的活性，轉錄因子c-Jun可通過激活其下游靶基因從而調控腫瘤的發生和發展[55]。在腫瘤中，異常激活的c-Jun可使PI3K、ERK介導的增殖相關通路持續活化[56]，并可使p53、Bcl-2介導的凋亡通路受阻，從而加速腫瘤的生長。在此過程中，c-Jun的活化依賴于其在細胞核中的定位，因此c-Jun在細胞核中的異常積累是導致腫瘤發生和發展的重要因素。

c-Jun有兩種入核方式。首先，它可通過其273～276位的NLS與多種NTR(如importin-5、importin-7、importin-8、importin-9、importin-13、importin-β和transportin)結合，并以Ran依賴的方式轉運至核內，這使得c-Jun的核轉運不依賴于某種特定的NTR，從而確保其能穩定地轉運至核內發揮作用[57]。但是importin-α會抑制c-Jun向核內轉運[58]。值得注意的是，在NLS中，273和275位氨基酸的突變會顯著降低c-Jun與importin-5、importin-9、importin-13以及importin-β的結合，而幾乎不影響其與importin-7或transportin的結合[58]。其次，c-Jun可通過“搭載”機制轉運至核內。c-Jun可與其他含有堿性亮氨酸拉鏈的內源性蛋白(如 c-Fos)形成異源二聚體，然后通過這些蛋白的NLS與importins結合，從而轉運至核內[57-58]。這些異二聚體在通過NPC時可能需要多種轉運蛋白的參與[73]。

有研究表明，c-Jun的入核不依賴于JNK介導的磷酸化以及二者的相互作用[57]。但是，c-Jun與JNK的結合可促進JNK向核內轉運[57]。c-Jun在核內的積累不依賴于其DNA結合能力，其核輸出也不依賴于exportin-1[57]。

3 總結與展望

以往對腫瘤發生發展的機制研究，大多集中在信號蛋白的異常表達或基因的異常轉錄上，而較少關注蛋白在亞細胞定位方面的差異。本文著重介紹了8種經典的腫瘤相關蛋白的核轉運機制，這將有助于了解腫瘤發生和發展的機制，并對腫瘤治療及預后評估至關重要。未來需要進一步的研究來闡明核轉運蛋白作為診斷、預后標志物，以及臨床治療靶標的潛力。