石菖蒲抗癲癇活性成分α-細辛醇鼻腔給藥大鼠的藥代動力學研究

李玥璇，梁麗紅，許茹，程培萱，肖超妮

(西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069)

α-細辛醇[反式-3-(2,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯-1-醇，MW=224]是抗癲癇中藥石菖蒲和“膽南星-石菖蒲”復方中的活性成分，也是“遠志-石菖蒲”及臨床藥物α-細辛腦膠囊體內(nèi)代謝的核心效應物[1]。依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院實施的抗癲癇藥物開發(fā)程序，在3種不同癲癇模型的研究中發(fā)現(xiàn)，α-細辛醇的抗癲癇活性優(yōu)于α-細辛腦膠囊、司替戊醇和卡馬西平而其神經(jīng)毒性卻較低[2]。α-細辛醇可預防H2O2介導的SH-SY5Y細胞凋亡，具有一定的神經(jīng)細胞保護作用[3]。α-細辛醇主要通過苯二氮卓結合位點對GABAA受體進行調控、通過抑制神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質細胞LDH活性，從能量代謝角度控制癲癇發(fā)生和通過促進氧化物酶體增殖激活受體PPAR-γ發(fā)揮活性[4]。2016年，α-細辛醇獲得中國發(fā)明專利證書(ZL201410692696.9)。

灌胃給藥α-細辛醇在正常大鼠和癲癇大鼠的生物利用度較低，到達腦內(nèi)的濃度更低從而影響療效；靜脈注射α-細辛醇在大鼠腦、心、脾、腎臟組織中均有分布，但是腦靶向特性卻不甚清楚[5]。癲癇發(fā)作時患者意識喪失、肢體抽搐、精神異常、牙關緊閉，口服或注射等常規(guī)給藥方式出現(xiàn)一定的難度，不適合于癲癇發(fā)作的急救和自救治療。鼻腔給藥利用大腦和鼻室通過嗅覺/三叉神經(jīng)通路和外周循環(huán)相互連接，繞過血腦屏障將藥物傳遞至大腦，避免胃腸和肝臟代謝提高藥物的生物利用度[6-7]。鼻腔給藥作為腦靶向給藥方式之一，與口服和透皮給藥相比，具有快速起效、非侵入性、易于給藥等優(yōu)點[8]。

為了探討α-細辛醇鼻腔給藥在抗癲癇疾病方面的可行性，本研究采用高效液相色譜法分析比較鼻腔給藥、靜脈注射和灌胃給藥α-細辛醇后大鼠血漿的藥代動力學特性及腦組織的分布情況，評價3種給藥方式的生物利用度和腦靶向特性，為α-細辛醇抗癲癇創(chuàng)新藥物研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑α-細辛醇(本實驗室合成，純度>99.0%)；α-細辛醚(上海麥克林生化科技有限公司)；吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司)；0.9%生理鹽水(西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜級，F(xiàn)isher Scientific)；甲酸、乙醚(分析純，天津市大茂化學試劑廠)。

1.2 動物 SPF級成年雄性Sprague-Dawley大鼠[合格證：SCXK(陜)2018-001]，體重180.0～220.0 g，購于西安交通大學醫(yī)學部動物研究中心。置于動物籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度保持為(20±2)℃，濕度為45%±3%，晝夜周期為12 h，可自由攝食和飲水。

1.3 儀器 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；BF2000氮氣吹干儀(北京八方世紀儀器)；UPD-Ⅱ-10T超純水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；TGL-16G高速離心機(上海安寧科學儀器)；SCIENTZ-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥液配制 稱取α-細辛醇0.050 0 g，置于研缽中，將1 mL生理鹽水和1 mg吐溫-80分次加入研缽中，研磨至完全溶解，配制α-細辛醇藥液(50 mg·mL-1)用于滴鼻給藥。稱取α-細辛醇0.768 0 g，置于研缽中，將96 mL生理鹽水和1.5 mg吐溫-80分次加入研缽中，研磨至完全溶解，配制α-細辛醇藥液(8 mg·mL-1)用于灌胃給藥和尾靜脈注射給藥。藥液置于4 ℃冰箱冷藏。

1.4.2 動物實驗 動物實驗經(jīng)西北大學動物倫理委員會批準，符合要求。大鼠72只，禁食12 h，自由飲水，隨機分為滴鼻給藥組、靜脈注射給藥組和灌胃給藥組，每組24只。腹腔注射7%水合氯醛對大鼠進行麻醉，仰臥位固定，在大鼠頸部正中剪開約3 cm切口，用鑷子剝離頸部肌肉，暴露出食道、氣管以及頸動脈血管，肺部端的氣管插入約2 cm的塑料管保證大鼠正常呼吸，頭部端的氣管用細線扎緊。滴鼻給藥組結扎食道、封閉口腔防止藥物進入胃腸道或肺部，α-細辛醇給藥劑量為25 mg·kg-1；靜脈注射給藥組和灌胃給藥組α-細辛醇的給藥劑量分別為25和50 mg·kg-1。

1.4.3 樣品采集與處理 將動物頸動脈血管的近頭端用細線系緊，近心端夾上止血夾，在距離止血夾約0.8 cm處用注射器頭扎孔后，將頸動脈插管插入血管后用細線系緊。在給藥后0、2、5、10、15、20、30、45、60、75、90、120 min取血0.5 mL，取血后立即夾上止血夾，用生理鹽水和肝素沖洗頸動脈插管防止血液凝固。血液經(jīng)離心(9 000 r·min-1，10 min，4 ℃)后，取上清180 μL置于離心管中，加入內(nèi)標物α-細辛醚20 μL(50 μg·mL-1)和乙腈600 μL，渦旋混勻，再次離心得上清液，用氮氣流吹干，殘留物用200 μL色譜流動相復溶，渦旋1 min，得血漿樣品用于HPLC測定。

在給藥后2、15、30 min，快速脫頸處死大鼠，低溫下迅速取腦，用生理鹽水沖洗干凈，對嗅區(qū)、嗅球、海馬、小腦、大腦皮層分區(qū)取材，用濾紙吸干表面水分進行稱重，加入5倍量溶劑(生理鹽水∶甲醇=1∶2)后用組織研磨器進行勻漿。勻漿液經(jīng)離心(9 000 r·mim-1，10 min，4 ℃)，取上清100 μL置于離心管中，加入乙腈300 μL，再次離心后，上清液用氮氣流吹干，殘留物用100 μL色譜流動相進行復溶，渦旋1 min，得腦組織提取液用于HPLC測定。

1.4.4 色譜條件 采用Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流速為0.7 mL·min-1，檢測波長為314 nm，進樣量為20 μL。流動相為甲醇(B)和2‰甲酸水(A)，血漿樣品的流動相梯度洗脫：40%B→70%B(0～15 min)，70%B→90%B(15～25 min)，腦組織提取液樣品的流動相梯度洗脫：40%B→70%B(0～15 min)。

1.4.5 方法學考察 專屬性：對空白血漿、α-細辛醇溶液(含α-細辛醚)、α-細辛醇和血漿混合液(含α-細辛醚)和灌胃給藥α-細辛醇后的血漿樣品，在相同HPLC檢測條件下進行分析。分別對空白腦組織提取液、α-細辛醇和空白腦組織提取液的混合液、灌胃給藥α-細辛醇后腦組織的樣品溶液，在相同HPLC檢測條件下進行分析。

線性曲線：精密配制α-細辛醇儲備液，稀釋后得到系列標準溶液(1 000、500、250、100、50、25、10、5、2.5、1 μg·mL-1)，取10份空白血漿(160 μL)，加入α-細辛醇各系列標準溶液20 μL和α-細辛醚溶液20 μL(50 μg·mL-1)，得到α-細辛醇(100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1 μg·mL-1)的血漿混合液，經(jīng)處理后采用HPLC進行測定，以α-細辛醇與α-細辛醚的色譜峰面積之比值與α-細辛醇的濃度進行回歸擬合，得線性方程。取10份空白組織提取液180 μL，分別加入α-細辛醇系列標準溶液20 μL，得到α-細辛醇(50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1 μg·mL-1)組織提取混合液，經(jīng)處理后采用HPLC進行測定，以α-細辛醇色譜峰面積與α-細辛醇濃度進行回歸擬合，得線性方程。

精密度和加樣回收率、穩(wěn)定性：取空白血漿/空白腦組織，加入α-細辛醇標準溶液，配制成低(0.5 μg·mL-1)、中(5.0 μg·mL-1)、高濃度(50.0 μg·mL-1)的樣品。在一天內(nèi)重復進樣分析(n=6)，計算日內(nèi)精密度和加樣回收率，連續(xù)6 d重復(n=6)進樣分析，計算日間精密度和加樣回收率。在室溫下放置2、4、8 h，考察α-細辛醇的短期穩(wěn)定性；于-80 ℃下冷凍30、60、90 d后取出，考察α-細辛醇的長期穩(wěn)定性；于-80 ℃下冷凍24 h，取出，室溫融解，重復操作3次，考察α-細辛醇的凍融穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 方法學考察 圖1為α-細辛醇在血漿樣品中的專屬性考察結果，α-細辛醇與內(nèi)標物α-細辛醚色譜峰保留時間相差較大，分離度好，且血漿內(nèi)源性代謝物的色譜峰對其無干擾。圖2為α-細辛醇在不同腦組織中的專屬性考察結果，α-細辛醇色譜峰峰形良好，且腦組織內(nèi)源性代謝物色譜峰對其均無干擾，分離度較好。這表明采用HPLC方法測定大鼠血漿和腦組織中α-細辛醇的含量時，方法專屬性良好。

A.空白血漿；B.α-細辛醇溶液(含內(nèi)標物α-細辛醚)；C.含α-細辛醇的大鼠血漿混合溶液(含內(nèi)標物α-細辛醚)；D.灌胃給藥α-細辛醇后的大鼠血漿

A.空白組織;B.含α-細辛醇的空白組;C.灌胃給藥α-細辛醇后的組織樣品

圖3為α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的標準曲線。其線性方程和相關系數(shù)分別為：血漿Y=0.400 3X-0.146 2(R2=0.993 8)；嗅區(qū)Y=36.76X-10.17(R2=0.998 9)；嗅球Y=30.10X+15.34(R2=0.993 6)；海馬Y=42.98X-15.59(R2=0.998 8)；小腦Y=21.09X-0.85(R2=0.992 3)；大腦皮層Y=19.48X+24.05(R2=0.993 9)。線性范圍均為0.1～50 μg·mL-1。

圖3 血漿和不同組織樣品中α-細辛醇的標準曲線

表1為α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中日內(nèi)精密度和日間精密度及相對應的加樣回收率考察結果，α-細辛醇的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD<7.2%，加樣回收率在89%～105%，參照生物樣品的藥物含量限度要求，精密度和回收率良好，表明該方法可靠。

表1 α-細辛醇在血漿和腦組織中的精密度和加樣回收率(Mean±SD，n=6)

表2～4分別為α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的短期、長期和凍融穩(wěn)定性考察結果。可見RSD<11%，回收率在86%～101%，表明α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性以及凍融穩(wěn)定性均良好。

表2 α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的短期穩(wěn)定性

2.2 α-細辛醇的血漿藥代動力學和生物利用度 對給藥后不同時間點的大鼠血漿進行HPLC分析，記錄相應的α-細辛醇色譜峰面積，由線性方程計算血漿中α-細辛醇的濃度。以取血時間點為橫坐標，以α-細辛醇濃度為縱坐標，繪制藥-時曲線(見圖4)。可以看出，灌胃給藥α-細辛醇在血漿中的濃度先升高再降低，而靜脈注射和滴鼻給藥α-細辛醇在血漿中的變化趨勢相似，均隨著時間增長而逐漸降低。灌胃給藥、滴鼻給藥和靜脈注射分別在45、75、120 min后均未檢測出α-細辛醇。

表3 α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的長期穩(wěn)定性

圖4 滴鼻給藥(i.n.)、靜脈注射(i.v.)和灌胃給藥(i.g.)α-細辛醇在大鼠血漿的藥-時曲線

表4 α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的凍融穩(wěn)定性

表5列舉了3種給藥方式下α-細辛醇在大鼠血漿中的藥代動力學參數(shù)。滴鼻給藥比靜脈給藥α-細辛醇的藥-時曲線下面積(AUC0～t)稍小，卻是灌胃給藥AUC0～t的2倍。體內(nèi)平均滯留時間(MRT)依次為靜脈給藥、滴鼻給藥和灌胃給藥，表明α-細辛醇滴鼻給藥在體內(nèi)停留時間較長。滴鼻給藥與靜脈給藥α-細辛醇后的最大血藥濃度(Cmax)相當，而滴鼻給藥劑量僅為灌胃給藥劑量的1/2，但其Cmax卻較大。滴鼻給藥與灌胃給藥α-細辛醇后血藥濃度達峰時間(Tmax)均為2 min，表明滴鼻給藥吸收迅速。滴鼻給藥和灌胃給藥α-細辛醇后的半衰期(T1/2)幾乎無差別，卻明顯低于靜脈給藥的半衰期；清除率(CL)依次為靜脈給藥、滴鼻給藥和灌胃給藥，發(fā)現(xiàn)鼻腔給藥遠大于灌胃給藥在體內(nèi)的消除速度。根據(jù)藥時曲線下面積(AUC)和給藥劑量D，計算滴鼻給藥α-細辛醇的絕對生物利用度為70.57%，而灌胃給藥的絕對生物利用度為19.31%。

表5 不同給藥方式下大鼠血漿中α-細辛醇的藥代動力學參數(shù)(Mean±SD，n=6)

2.3 α-細辛醇的腦組織分布及腦靶向性評價 圖5為不同時間點大鼠腦組織中α-細辛醇濃度的變化。當給藥2 min后，滴鼻給藥和靜脈給藥在大鼠5個腦區(qū)(嗅區(qū)、嗅球、海馬、小腦、大腦皮層)有α-細辛醇的分布，灌胃給藥僅在1個腦區(qū)(海馬)有α-細辛醇的分布；當給藥15 min后，滴鼻給藥和靜脈給藥在大鼠4個腦區(qū)(嗅區(qū)、嗅球、海馬、小腦)有α-細辛醇的分布，灌胃給藥在2個腦區(qū)(海馬和嗅區(qū))有α-細辛醇存在，大腦皮層中均未檢測到α-細辛醇；給藥后30 min，滴鼻給藥和靜脈給藥仍在大鼠4個腦區(qū)(嗅區(qū)、嗅球、海馬、小腦)發(fā)現(xiàn)α-細辛醇，而灌胃給藥后在3個腦區(qū)(嗅區(qū)、海馬、和小腦)有α-細辛醇存在。

圖5 滴鼻給藥(i.n.)、靜脈注射(i.v.)和灌胃給藥(i.g.)大鼠腦組織中α-細辛醇濃度

Bi.v.為靜脈注射給藥大腦AUC，Pi.v.為靜脈注射給藥血漿AUC，PT為其他給藥方式血漿AUC，BT其他給藥方式大腦AUC，當DTP%>0表示藥物具有腦靶向潛能。表6列舉了α-細辛醇在大鼠嗅區(qū)、嗅球、海馬、小腦和大腦皮層的DTI和DTP%值。滴鼻給藥α-細辛醇在嗅球、海馬、小腦和大腦皮層的DTI值均大于1且DTP%值均大于0，嗅球的DTI和DTP%顯著高于其他腦區(qū)。相比而言，灌胃給藥α-細辛醇在嗅區(qū)、海馬和小腦的DTI值大于1且DTP%值大于0，海馬區(qū)域的DTI和DTP%高于其他腦區(qū)。

表6 大鼠嗅區(qū)、嗅球、海馬、小腦和大腦的DTI和DTP值

3 討論

對α-細辛醇在3種給藥方式下大鼠血漿的藥代動力學參數(shù)進行了系統(tǒng)分析。滴鼻給藥和靜脈注射α-細辛醇均在2 min達到相近的最大血藥濃度，表明滴鼻的藥物吸收迅速之快，可與靜脈注射的藥物吸收速度相媲美。滴鼻給藥與靜脈給藥α-細辛醇的藥時曲線下面積相近，表明α-細辛醇通過鼻黏膜更好地吸收進入體循環(huán)，這可能與α-細辛醇的親脂性和低分子量有關[10]。與灌胃給藥相比，滴鼻給藥α-細辛醇的達峰時間明顯縮短，這與芬太尼鼻腔給藥的藥代動力學特征相似，其鼻腔給藥比灌胃給藥的吸收速度大，具有起效快的特點[11]。滴鼻給藥比灌胃給藥α-細辛醇的最大血藥濃度稍大，這是由于滴鼻給藥劑量僅為灌胃給藥劑量的1/2。文獻報道了α-細辛腦的大鼠口服劑量是鼻腔給藥劑量的4倍時，兩種給藥方式的血藥濃度才比較相近，這表明鼻腔能有效吸收藥物入血[12-13]。滴鼻給藥比灌胃給藥α-細辛醇的平均滯留時間較長，清除速率較小、半衰期幾乎無差別，表明α-細辛醇滴鼻給藥在體內(nèi)停留時間長，可更好的發(fā)揮治療作用。

灌胃給藥α-細辛醇的絕對生物利用度為19.31%，這與文獻報道其在正常大鼠的絕對生物利用度接近[5]。而滴鼻給藥是灌胃給藥α-細辛醇絕對生物利用度的3.6倍。Hussain等[14]發(fā)現(xiàn)灌胃給藥普萘洛爾的生物利用度為15%，而鼻腔給藥和靜脈給藥生物利用度相似，且遠大于灌胃給藥。有文獻報道脂溶性藥物咪達唑侖經(jīng)鼻噴霧劑給藥的絕對生物利用度達到88%[15]。分子量小的化合物(Mw<1 000)鼻腔給藥后吸收效果好、生物利用度較高，親脂性藥物鼻腔給藥后生物利用度明顯高于灌胃給藥，而親水性藥物鼻腔給藥后生物利用度與灌胃給藥幾乎沒有差別，這表明分子量和藥物脂溶性是影響鼻黏膜吸收的重要因素[16]，有機小分子更適合通過鼻內(nèi)給藥到達循環(huán)系統(tǒng)[17]。由此推斷，α-細辛醇鼻腔給藥的絕對生物利用度高，與其分子量小、親脂性好有關。此外，鼻腔給藥途徑可以避免首過效應，也是α-細辛醇鼻腔給藥絕對生物利用度高的主要因素。

滴鼻給藥α-細辛醇在2 min之內(nèi)快速且均勻地分布到各個腦區(qū)，而灌胃給藥在30 min內(nèi)僅在腦部3個腦區(qū)有分布，分布速度較慢且分布量不均勻。滴鼻給藥α-細辛醇在嗅球中藥物濃度明顯高于靜脈注射和灌胃給藥，這與經(jīng)鼻給藥α-細辛腦在嗅球中的濃度高于其余兩種給藥途經(jīng)的結果相一致[13]。相比于灌胃給藥，滴鼻給藥α-細辛醇的腦靶向指數(shù)和腦靶向潛能較高，表明滴鼻給藥α-細辛醇的腦靶向性更好。這是由于鼻腔給藥后，藥物通過鼻黏膜更好的吸收到嗅覺上皮，繞過血腦屏障直接進入大腦的緣故[18]。從腦靶向指數(shù)和腦靶向潛能指標上推斷，α-細辛醇在的腦靶向在嗅球區(qū)域，而灌胃給藥腦靶向在海馬區(qū)域。

本文建立了血漿和腦組織中α-細辛醇的HPLC測定方法，方法學考察顯示專屬性、回收率、精密度和穩(wěn)定性均良好，可用于α-細辛醇在大鼠血漿藥代動力學和腦組織的分布研究。鼻腔給藥α-細辛醇具有吸收迅速、體內(nèi)滯留時間長和生物利用度高等特點，能夠快速分布到海馬、小腦、嗅球和大腦皮層，且在嗅球中的腦靶向性最高。鼻腔給藥α-細辛醇通過嗅球直接從鼻腔的嗅上皮進入腦組織，可以作為一種有效給藥途徑用于癲癇的及時救治。