軟籽石榴的組織培養

閆曉丹

（河南省鄢陵縣農業技術推廣中心，河南 鄢陵 461200）

一、石榴分布與繁殖現狀

1、石榴的分布

石榴是漿果類植物，屬于落葉灌木類，依據果實的顏色和甜度可分為紅籽甜石榴、白籽甜石榴、酸石榴以及觀賞類石榴這4個種類。石榴的原產地是印度西北部一帶，在紀元前進入中國，在中國已有兩千多年的歷史。

石榴有非常豐富的營養價值，果實中碳水化合物、鈣、維生素等物質含量較高。果實一般鮮食，市場上也有很多石榴產品，如罐頭、果茶、果酒等。石榴花的周期是3 個月左右，具有較好的觀賞性；葉片對重金屬蒸氣有很強的吸附能力，對凈化空氣有很好的效果；石榴果皮有止血、驅蟲的作用，在燒傷、細菌性痢疾的治療上也有較好效果，還對消化系統、生殖系統有一定抗菌、抗病作用。

石榴生長對土壤要求不高，全國范圍內都可種植，既是園林綠化的優秀種類，也是不錯的經濟作物。主要分布在亞熱帶和溫帶地區，中國南北各地均可栽培，其中以江蘇、安徽、陜西、河南、四川、云南、山東等省較多。目前，石榴已經成為農民致富的支柱產業之一。

2、石榴的繁殖現狀

石榴采用無性繁殖，以保持其優良性狀的遺傳穩定性和一致性，但傳統的無性繁殖方法繁殖數量少、速度慢，不能適應現代化生產要求。通過組織培養，可以快速大量進行繁殖和推廣，在短期內提供大量的無性苗木和脫毒苗木。研究軟籽石榴組織培養方法，可以建立石榴組培快繁體系，為進一步開展倍性育種奠定基礎。

二、果樹組織培養的影響因素

1、基本培養基

在選擇果樹組織進行培養時，培養基選擇MS 和1/2MS。1/2 MS 培養基主要用于根的培養，選擇3%蔗糖、0.7%瓊脂，pH 值范圍在5.6～5.8。曹效東等比較了MS、N6、B5、Read等4 種基本培養基對離體芽存活率的影響，不同基本培養基上離體芽的存活率存在較大差異，以MS 效果最好，B5 次之，N6 和Read 較差。研究結果顯示，基本培養基的成分和用量比例對離體芽的生長有至關重要的影響，調整培養基后離體芽的生存活力有明顯提高，基本培養基的成分和比例直接關系著離體芽的再生存活效果[1]。

2、培養條件

果樹組織基本培養基溫度一般在25～28℃，光照強度在40μmol/m2·s 左右，光照時間每天16 h。光照時長對離體芽的存活有關鍵作用，光照強度過大會致使離體芽光合作用過快導致枯竭，弱光照射適合7～14 天的離體初期，14 天后可正常光照，7～14 天的培養基溫度在20℃左右為宜[2]。

三、突尼斯軟籽石榴扦插枝條組織培養

1、扦插苗和組培苗的培養

從鄭州滎陽劉溝村成年軟籽石榴樹上，剪取1 年生休眠（落葉）枝條，長10～15 cm，在清水中浸泡24 h 后，扦插在滅菌后的蛭石中，使其處在20～22℃下，光照16 h，黑暗8 h，在人工氣候室內進行培養。當休眠芽陸續萌發成幼嫩枝條，取石榴扦插枝上生長出的新梢，用自來水沖洗5～10 次。在超凈工作臺上切取帶芽莖段1.0 cm 左右，用75%乙醇浸泡30 s，用0.1%氯化汞浸泡8～10 min，再用無菌水漂洗材料5～6 次，放入無菌水中待用。

2、增殖培養和繼代培養

把泰山紅石榴的增殖培養基和繼代培養基應用于軟籽石榴，將已滅菌的帶芽莖段接種在MS+6-BA（1.2 mg/L）+IBA（0.1 mg/L）培養基上，每瓶3～5 個外植體，共40 瓶。待培養基中的帶芽莖段長出叢生芽后，將叢生芽由瓶中取出，用解剖刀切取莖2 cm，每段帶4～5 個葉片，接種在MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）培養基上，在人工氣候室內進行培養。

3、愈傷組織的誘導

把泰山紅石榴誘導分化培養基應用于軟籽石榴愈傷組織的培養，取繼代培養20～30 天的組培苗頂部1～4 葉位，正在伸展或已經完全展開的幼嫩葉片，用解剖刀切去葉尖和葉柄，并在葉片中脈處橫切3 刀，但保持葉片完整[3]。然后把刻傷的葉片平鋪在盛有30 mL 分化培養基上，即MS+KT（0.1 mg/L）+6-BA（1.0 mg/L）+GA3（0.5 mg/L），葉背面向下。接種后先在黑暗處理2 周，然后轉移到光下培養，培養溫度為25℃，光照時間16 h/天，光照強度為1500～2000 lx。莖段剪成約1.0cm小段，放置在MS+6-BA（1.2mg/L）+IBA（0.1mg/L）培養基上。

4、培養條件

增殖培養條件。基本培養基為MS，蔗糖30g/L、瓊脂粉6g/L、椰汁200mL/L、pH值調至5.8。培養基在121℃、131kPa 條件下滅菌20 min。接種完成后放入光照培養箱中培養，溫度為（26±2）℃，光周期為光照16 h、黑暗8 h，光照強度為1500～2000 lx。

繼代培養基為MS+6-BA（1.2 mg/L）+IBA（0.1 mg/L），愈傷組織誘導分化培養基為MS+6-BA（1.0 mg/L）+KT（0.1 mg/L）+GA3（0.5 mg/L）。

四、培養效果

1、休眠枝條的培養

扦插在蛭石中的石榴枝條處在20～22℃的環境下，光照16 h，黑暗8 h。20 天后休眠芽陸續萌發成幼嫩枝條，生長良好，詳見圖1。由此可知，此環境適合休眠枝條的生長，并能為以后提供大量供試材料。

圖1 扦插枝條

2、石榴組培苗的增殖培養和繼代培養

把泰山紅石榴的增殖培養基和繼代培養基應用于軟籽石榴在人工氣候室內進行培養，經過20 天后，生長勢良好，詳見圖2、圖3。由此可知，泰山紅石榴的增殖培養體系和繼代培養體系也符合軟籽石榴的增殖培養和繼代培養。

圖2 接種后的莖段

圖3 接種后的叢生芽

3、愈傷組織誘導

把泰山紅石榴誘導分化培養基應用于軟籽石榴愈傷組織的培養，經過30 天后，生長勢良好，詳見圖4。由此可知，泰山紅石榴誘導分化培養基MS+KT（0.1 mg/L）+6-BA（1.0 mg/L）+GA3（0.5 mg/L）同樣適用于軟籽石榴愈傷組織的培養。此外，葉片經過適當的刻傷可以縮短愈傷組織的誘導時間，詳見圖4、圖5。

圖4 經過刻傷的葉片

圖5 沒有刻過的葉片

4、褐化處理

由于植物組織在切割時會分溢一些酚類物質，接觸空氣中的氧氣后，自動氧化或由酶類催化氧化為棕褐色的醌類物質。這種物質會毒害外植體組織，使培養材料生長停止，失去分化能力，最終變褐死亡。

前期接種苗中，此問題比較嚴重。因此，在石榴莖段消毒前用抗氧化劑VC100 mg/L 分別浸泡石榴莖段10 min、20 min、30 min。結果表明，石榴莖段浸泡10 min 對其褐化程度影響不明顯；浸泡20 min 后其褐化程度減少，且生長良好；浸泡30 min 后，褐化程度減輕，但對苗子有傷害，致使其發芽速度減慢，詳見圖6、圖7、圖8。

圖6 浸泡10 min

圖7 浸泡20 min

圖8 未浸泡

五、培養中出現的問題

1、污染

在前期接種中，組培苗污染較多，可能是材料滅菌不徹底、或者接種方法不當、培養環境不清潔等原因導致。在以后的接種中要逐步完善接種方法，嚴格進行無菌操作，保證污染率較低。

2、消毒

后期接種中，出現較多無污染卻不能發芽的死亡苗，可能是消毒過重導致。隨著溫度變化，氣候室中的組培苗生長加快，很多腋芽已經萌發，此時消毒時間過長或者消毒時晃動過猛很容易將已萌發的腋芽殺死，致使莖段不能萌發。在今后的試驗中要盡可能縮短75%乙醇的消毒時間，可以縮短為10 s，或只用0.1%氯化汞消毒，減輕對組培苗的毒殺危害。

3、褐化

由于組培苗的褐化現象比較嚴重，在試驗中利用抗氧化劑VC100 mg/L 浸泡20 min，使其褐化程度減輕。今后還有待于探索更好的降低褐化方法。

4、刻傷

在誘導葉片的愈傷組織培養中，發現有一些葉片變黑至死，可能是刻傷過重致使葉片損傷嚴重。在以后的操作中，要注意不能用力過度，但還要保證有刻痕，使其能形成愈傷組織，可以嘗試用解剖針在葉片上輕劃。

六、結論

休眠枝條扦插在蛭石中，使其處在20～22℃環境下，光照16 h，黑暗8 h，其休眠芽能萌發成幼嫩的枝條，且生長良好。石榴莖段在消毒前用VC100 mg/L 浸泡20 min，有利于減輕其褐化程度。在誘導愈傷組織時，適當在葉片上刻傷有利于葉片愈傷組織的誘導。泰山紅石榴的組培體系適合于軟籽石榴的組織培養。以上只是軟籽石榴組織培養的初級階段，今后還要繼續探索，尋找更利于軟籽石榴組培、快繁的方法。