云南景邁古茶園茶葉內生真菌多樣性初步研究

張建坤，周 劍，彭 超，王 琴，汪 飛，王振華

（1.武漢理工大學，武漢 430070；2.思茅海關綜合技術服務中心，云南 普洱 665000；3.中國質量認證中心武漢分中心，武漢 430062；4.武漢海關技術中心，武漢 430054）

早在1884 年，Heinrich Anton de Bary 提出內生菌（Endophyte）一詞，指在植物組織中存在的任何微生物體。現在認為，在植物生命的某一段時間內，完全或部分生活史階段可以在植物組織內部定殖且不對宿主本身造成明顯傷害的微生物都是內生菌。自1898 年Vogl 于黑麥草（Lolium perenneL.）的種子中分離得到第一個內生真菌以來，植物組織中內生真菌便一直倍受研究者關注。這些內生真菌在陸地生態系統中起著關鍵作用，極大地影響著植物個體的生長發育、種群進化、群落結構和環境適應性［1］。迄今為止，認為植物內生真菌（Endophytic fungi）是對植物貢獻最大的一類內生菌。內生真菌不僅在宿主植物內發揮多種重要作用，也是人類孜孜以求的珍貴真菌資源，大量研究表明，部分內生真菌在醫藥、農業、環境等領域顯示了良好的應用前景［2-4］。

茶樹（Camellia sinensis）是一種原產中國的常綠喬木，茶葉中富含多胺、多酚、咖啡因、花青素和其他成分，茶飲品成為人類最為喜愛的飲品之一。茶樹全株都有內生真菌分布，與茶葉的品質和茶飲品的口感密切相關。據統計，截至2020 年9 月份，已經報道的茶樹內生真菌包括3 門5 綱14 目24 科34 屬，其中刺盤孢菌（Colletotrichumspp.）、間座殼菌（Dia?porthespp.）、青霉菌（Penicilliumspp.）和木霉菌（Trichodermaspp.）是茶樹的優勢內生真菌［5］。研究表明，地理環境、茶樹種類與品種、不同組織對內生真菌的優勢種群分布和群落結構都有決定性的影響［6，7］。本研究以云南省景邁縣千年古茶園茶葉為研究對象，分離并鑒定了干燥茶葉的內生真菌，發現了多個新的茶葉內生真菌和多個新的真菌種，初步揭示了古茶園茶葉內生真菌的多樣性和特異性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

2017年10月，從中國云南省景邁縣惠民鄉景邁村和芒景村的一處古茶園中采集茶葉樣品。古茶園已有1 300 多年的普洱茶種植歷史，種植面積1 800 hm2。取樣茶樹樹齡都在千年以上，株高2~10 m。隨機選擇植株，采集有或無明顯病害癥狀的茶葉，將同一株茶樹的茶葉放入一個無菌塑料袋中，48 h 內帶回實驗室。除少數樣品用于病原菌分離外，其余樣品裝入牛皮紙袋中自然干燥，室溫保存。

1.2 內生真菌分離與純化

挑選健康、無明顯病斑的干燥茶葉，用自來水沖洗2 次，75% 乙醇浸泡60 s，再用0.5% 次氯酸鈉浸泡3 min，75% 乙醇漂洗30 s，最后用無菌蒸餾水洗滌3次，用于茶葉表面殺菌。用無菌剪刀將表面殺菌后的茶葉剪成大小0.2 cm×0.2 cm（長×寬）的葉組織塊。取4 個葉組織塊均勻地放置于PDA 平板周邊，每片茶葉重復接種3 個平板。作為對照，加入100 μL 最后一次洗滌水于相同的平板中，以檢驗表面殺菌的效果。用封口膜密封培養皿，于恒溫培養箱中（25±0.3）℃培養7 d，定期檢查菌絲生長情況。將具有明顯真菌菌落特征的菌絲轉接至新的PDA 平板中，（25±0.3）℃培養，以獲得純培養物。

1.3 內生真菌ITS 擴增

將真菌純培養物接種于含15 mL PDB 的100 mL錐形瓶中，在（25±0.3）℃條件下靜置培養7 d。菌絲經過濾后，在液氮中充分研磨成粉末，用于基因組DNA 提取。用PureLinkTM植物基因組DNA 純化試劑盒（Invitrogen，Thermofisher，Shanghai，China）提取基因組DNA，操作步驟按照產品說明書進行。用保守引物ITS1F 和ITS4R 進行PCR，擴增rDNA 的ITS（In?ternal Transcribed Spacer）序列，或用引物EF1-728F和EF1-986R 擴增TEF（Translation Elongation Fac?tor）基因（表1）。

表1 茶葉內生真菌ITS 和TEF 的PCR 引物和擴增條件

用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，DNA片段大小預計在450~700 bp（ITS）或180~250 bp（TEF）。

1.4 DNA 測序與系統進化分析

PCR 產物直接送至上海生工公司測序。將所得序列用BLASTn 程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）在GenBank 數據庫中搜索最佳匹配序列。在MEGA7.0中，用Clustal W 對DNA 序列進行多重比對，用鄰接法（Neighbour Joining Method）構建DNA 的系統發育樹，Bootstrap 分析重復1 000 次。

2 結果與分析

在PDA 平板上共接種486 個葉組織塊，獲得103 個純培養的真菌分離物，分離率為21.2%。根據菌落的形態學特征，從中選取30 個真菌分離物，進行ITS 的PCR 和測序。分離物1 未能獲得測序結果，后改用TEF 引物進行PCR 和測序，從而獲得TEF 基因的序列。30 份DNA 序列已提交至GenBank 相關數據庫，登錄號為MZ617296-MZ617324。

Blastn 搜索和比對結果顯示，30 個分離物分別屬于2 門3 綱7 目11 科13 個屬（表2），其中23 個是子囊菌，余下6 個是擔子菌，分離物20 為糞殼菌綱（Sordariomycetes）真菌，但未獲得屬一級水平的分類信息。屬于鬼傘屬（Coprinellus）的分離物最多，有6個，占比為20.0%，是茶葉樣品中內生真菌的優勢屬，多節孢屬（Nodulisporium，16.7%）、炭團菌屬（Hy?poxylon，13.3%）和輪層炭菌屬（Daldinia，10.0%）依次排在其后。

用鄰接法構建了29 個分離物的ITS 系統發育樹（圖1），23 個子囊菌分離物和6 個擔子菌分離物構成發育樹的2 個大支。分離物24 是子囊菌，與對應的最佳匹配分離物的序列相似性僅有90.87%，E值為5e-172（表2），表明該分離物與最佳匹配分離物的親緣關系較遠，在發育樹上與同是炭團菌的分離物14、17 和25 相差甚遠，獨自構成一個分支。分離物5、6、10、18、21、26 同為鬼傘屬，在進化樹中構成同一分支，且自展值為100，較為可信。然而，分離物6、10、18、21、26 與對應分離物的序列相似性都只有96% 左右（表2），與同為鬼傘菌的分離物5 也存在一定差異。

圖1 茶葉內生真菌ITS 序列的系統發育樹

表2 茶葉內生真菌的可培養分離物a

3 討論

本研究以云南景邁古茶園的普洱茶葉為試驗材料，用平板培養法從儲存3 年多的干燥茶葉樣品中分離內生真菌。盡管內生真菌的分離率比較低，僅21.2%，與常規的新鮮茶葉達到80% 或更高的分離率相距甚遠，但仍獲得了13 個屬的內生真菌分離物，初步展示了古茶園茶葉內生真菌的多樣性。

與以往報道不同，本研究沒有分離到常見的茶樹內生真菌，如青霉菌、炭疽菌（Colletotrichumspp.）、鐮刀菌（Fusariumspp.）、間座殼菌、擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsisspp.）、莖點霉菌（Phomaspp.）、擬莖點霉菌（Phomopsisspp.），但也分離到了常見的木霉菌和鏈格孢菌（Alternariaspp.）［5-10］。根據現有文獻報道，本研究獲得的1 目4 科8 屬共20 個真菌分離物是新發現的茶樹內生真菌，其中所有的碳團菌、多節孢菌（Nodulisporiumspp.）、鬼傘菌等分離物都未曾在茶樹植物中報道過（表3）。有報道顯示，用PDA 平板培養法分離云南省一處野生茶園茶葉的內生真菌，但沒有分離到這8 個屬的內生真菌［11］。還有研究表明，用二代測序技術分析茶葉的內生真菌，在檢測到的35 個高相對豐度的OTU（Operation?al Taxonomic Unit）（科一級水平）中，也沒有檢測到本研究分離到的這8 個屬的內生真菌［12］。此外，分離物24 與對應的最佳匹配分離物的序列相似性僅90.87%，極可能是真菌界里的新種或新屬，而分離物6、10、18、21、26 與對應分離物的序列相似性也只有96% 左右，可能是鬼傘屬的新種，需要后續鑒定才能確定它們的分類地位。

表3 本研究新發現的茶葉內生真菌分離物

云南景邁、芒景境內的千年古茶園是目前世界上保存最完好、年代最久遠、面積最大的自然茶園。古茶園有近乎封閉的自然環境，人為干預少，其內生菌種類和其他人工栽培茶園應該存在較大的區別，本研究結果證明了這一點。此外，本研究采用的干燥茶葉樣品也可能是造成這種差別的重要原因，干燥可能改變了部分茶葉內生真菌的群落結構，從而導致了內生真菌在PDA 平板上的不同生長格局，最終產生了與新鮮茶葉不同的結果，顯示了云南景邁古茶園茶葉內生真菌的特異性。

本研究結果只是揭示了云南景邁古茶園茶葉內生真菌多樣性的冰山一角，但為后續茶樹內生真菌的研究提供了參考。如果以新鮮茶樹樣品作試驗材料、組合使用多種培養平板等，應該可以分離到更多種類的內生真菌。如果平板培養法與高通量的二代測序技術相結合，則可以更多地揭示茶樹內生真菌的多樣性。據此，可以解釋古茶園茶樹內生真菌的生態學意義，還可以發掘更多有價值的真菌種類，為未來在醫藥、農業、環境等應用領域提供寶貴的真菌資源。