牡丹不同木質化程度枝條的紅外光譜分析

李秀麗，陳 鎮，戢小梅，戴志剛，陳法志，陳志偉，翟敬華

（1.武漢市農業科學院林業果樹研究所，武漢 430075；2.湖北省耕地質量與肥料工作總站，武漢 430070）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）原產中國，屬多年生落葉灌木，因極具觀賞和藥用價值而被人們熟知，目前已有2 000 多年的栽培歷史［1，2］。近幾年研究發現鳳丹白（Paeonia ostii‘Fengdanbai’）籽仁中含油率較高，在22% 以上，高于國產大豆的含油率（17.5%）。牡丹籽油中富含氨基酸、蛋白質、多糖、類胡蘿卜素、微量元素及維生素群和多種不飽和脂肪酸，尤其是α-亞麻酸的含量超過42.35%，被稱為液體黃金［3］。2011 年國家衛生部批準牡丹籽油為一種非傳統新植物油資源，在國內外掀起一股牡丹熱，中國牡丹也將以油用牡丹的角色再次進入一個繁榮發展的歷史時期。牡丹在生長和栽培中存在以下特征和問題：一，牡丹的生長不同于其他植物，存在“長一尺退八寸”的“退枝”現象。牡丹由多種木質化程度不同的枝條組成，包括木質化程度較高的多年生枝條、木質化程度次之的一年生新枝下部及木質化程度最低的一年生新枝上部，新枝上部因木質化程度低，耐寒性較差，冬季便自行枯死，僅剩一年生枝條的下半部越冬，這一部分才是牡丹枝條長度當年的實際生長量，僅為當年生長量的1/4~1/3，被稱為“退枝”。二，高溫是限制牡丹生長的重要環境因素，隨著高溫時間的延長，葉片出現失綠、黃化、焦枯、提早落葉，直至植株死亡。在中國本地，存在著一些較能適應高溫的品種，如鳳丹白，卻仍然避免不了高溫引起的生育期短、落花落果等現象的發生，嚴重阻礙了牡丹在長江中下游及以南地區的推廣種植［4，5］。三，牡丹傳統繁殖方法以播種、嫁接和分株為主，存在遺傳性狀不穩定和繁殖效率低的現象，無法滿足市場需求。研究人員嘗試通過扦插來提高牡丹的繁殖效率，但扦插效果有待提高［6］。值得注意的是，越來越多的研究顯示，植物的生長特性與栽培中存在的問題與枝條的木質化程度息息相關，尤其是植物的耐熱性和扦插效果等［6-8］。然而，有關牡丹枝條木質化方面的系統研究鮮有報道，本研究將從光譜學和蛋白質化學角度入手，解析不同木質化程度枝條的化學成分基礎，深入解析牡丹的生長特性，并為提高牡丹抗性和扦插效果奠定理論基礎。

FTIR（Fourier Transformation Infrared Spectrosco?py，FTIR）光譜技術的優勢在于可以通過特征振動峰進行物質鑒定，是近年來廣泛應用于農業材料上的一種新型光譜手段，可快速準確地分析農業材料（如花粉、植物油、中藥、木材）的物質成分［9-13］。此外，借助FTIR，還可對蛋白質二級結構［9］、蛋白質反應的分子機制［14］和蛋白質的折疊［15］進行系統的分析。FTIR 圖譜中氨基Ⅰ的振動在1 650 cm-1附近，主要來源于C=O 的伸縮振動及少量的CN 面外彎曲振動、CCN 變形振動和NH 的面內彎曲振動［16］。氨基Ⅰ振動峰的強度和峰型與蛋白質的骨架結構密切相關，而與蛋白質的側鏈結構關系不大，即主要取決于蛋白質主鏈上的二級結構［17］。因此，一般選用氨基Ⅰ區域的振動峰進行蛋白質二級結構分析。本研究的目的是通過FTIR 技術分析比較牡丹不同木質化程度枝條中物質成分的差別及變化規律，并通過高斯多峰擬合從蛋白質化學角度分析各組織內蛋白質二級結構的分布特點及變化趨勢，為其他相關研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4 年生鳳丹白苗購買于山東省菏澤市，2015 年10 月以大田栽植的方式種植于武漢市農業科學院林果所牡丹資源圃，種植密度為40 cm×80 cm。并根據牡丹苗生長情況統一進行澆水、施肥、除草以及病蟲害防治管理。

1.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征

切取新鮮的鳳丹牡丹的莖和葉柄，先后用清水和去離子水（>18 MΩ）清洗，將清洗干凈的牡丹植株器官（莖和葉柄）鮮樣切碎后，置于110 ℃殺青1 h，75 ℃烘干至恒重。然后用球磨儀將樣品粉碎成粉末（粒徑小于2 μm）。采用KBr 壓片法，即取1~2 mg干燥的樣品與200 mg 干燥的KBr 研成均一細粉（粒徑小于2 μm），以免散射光影響。底模裝入模膛，往模心中加入少量樣品，用藥匙將模具中的樣品刮平，并使其中心略高，將頂模放入模心，用（5~10）×107Pa壓力在液壓機上壓成透明薄片（1~2 min），將KBr 壓片夾放入紅外光譜儀中（Bruker vertex 70）的透射配件中，以KBr 空白片（或空氣）為參比，選用4 cm-1的分辨率，掃描128 次；波數范圍4 000~400 cm-1［18］。

1.3 數據擬合及分析

借助Origin 8.0 統計軟件對FTIR 原始數據進行作圖，選取氨基I 區域（1 700~1 600 cm-1）的曲線并對其進行高斯單峰正態分布的曲線擬合，再根據不同蛋白質二級結構的FTIR 峰位，對擬合曲線再次進行高斯多峰擬合，具體分峰數依據結果而定。

2 結果與分析

2.1 鳳丹白枝條的發育特點

鳳丹白為落葉灌木，莖干直立，分支短而粗壯（圖1a）。根據木質化程度不同，依次為：木質化程度最高的多年生枝條（枝條1），枝皮為褐灰色，有縱紋（圖1b）；木質化程度次之的枝條，位于葉腋內有芽點（頂芽）的一年生枝條下部（圖1b 和圖1c），枝皮為淺黃綠色，稱之為木質化程度較高的一年生枝條（枝條2）（圖1b）；木質化程度最低的枝條主要是指葉腋內無芽點的一年生枝條上部（圖1b 和圖1c），將其定義為木質化程度較低的一年生枝條（枝條3）（圖1c）。從枝條1 到枝條3 木質化程度逐漸降低。

圖1 不同類型枝條的界定

2.2 枝條的FTIR 特征

和標準歸屬詳見表1。結合圖2 和表1 可以看出，不同木質化程度枝條的FTIR 特征峰差異較大，也存在一定的規律性，比如778 和3 420 cm-1處的特征峰隨木質化程度的增加而逐漸減弱。778 cm-1特征峰是由于C-C 伸縮振動引起，屬于碳水化合物［19］，表明枝條中碳水化合物的含量隨木質化程度的增加而降低；3 420 cm-1處的特征峰歸屬于OH 伸縮振動，主要源于組織中脂肪酸、各種碳水化合物（果膠、半纖維

圖2 枝條的FTIR 圖譜的比較

表1 枝條FTIR 圖譜的主要峰位及其歸屬

圖2 表明，鳳丹白不同類型的枝條從4 000 cm-1到400 cm-1共存在12 個特征峰，其對應的振動頻率素、多糖）等對光譜的貢獻［20］。1 253、1 385、1 461 和1 738 cm-1處特征峰的振動強度隨木質化程度的增加而逐漸增強。1 253 和1 738 cm-1處特征峰分別對應磷脂質和核酸的P=O 對稱伸縮振動［21］以及磷脂質和油脂的C=O 伸縮振動［22］；1 385 cm-1處的特征峰代表CH3和CH2的對稱變形彎曲振動，主要來源于蛋白質、脂質和木質素［21］；1 461 cm-1為蛋白質、脂類和木質素的CH3和CH2反對稱變形彎曲振動［21，22］，可見木質化程度高的枝條中含有更多的木質素成分。1 043 cm-1特征峰的峰位在枝條1 到枝條3 的過程中分別發生了藍移，枝條1 中1 043 cm-1處振動峰，枝條2 和3 中，變為1 053 cm-1，此區域峰位對應細胞壁多糖COH 變形振動或C-O 伸縮振動［22，23］。表明鳳丹白枝條1 的細胞壁多糖以葡甘露聚糖為主，而枝條3 的細胞壁多糖以阿拉伯聚糖為主。枝條1 和2中1 426 cm-1特征峰在枝條3 中移動至1 410 cm-1。據文獻報道1 450~1 410 cm-1屬于果膠或氨基酸COO-的對稱伸縮振動峰［22，24］。此外，1 511 cm-1處特征峰屬于氨基II 的N-H 伸縮振動［25］，該峰峰強隨木質化程度的降低而減弱，枝條3 中則不存在此峰。1 636 cm-1為氨基I 的C=O 伸縮振動和NH 彎曲振動，與蛋白質二級結構相關［22］，其他特征峰無明顯變化趨勢。

2.3 不同種類枝條的蛋白質二級結構特性

為了進一步分析鳳丹白不同類型枝條中蛋白質二級結構的特征及其差異性，對1 700~1 600 cm-1處的紅外吸收峰進行詳細分析。首先對1 700~1 600 cm-1的原始譜圖（圖3 中黑色實線）進行高斯單峰擬合，擬合方程為：

不同枝條中擬合方程的具體參數見表2，高斯單峰擬合曲線如圖3 中黑色實線。

表2 枝條中氨基I（1 700~1 600 cm-1）區域的擬合參數

根據蛋白質二級結構的峰位（表3 所示），再對擬合單峰（圖3 中紅色實線）進行高斯多峰擬合［9］。1 700~1 600 cm-1存在5 種蛋白質的二級結構，波數從低到高為：β+S+P、β、α、L+T 和β+T，其中L、T、α、β、S 和P 分別代表環（loop）、轉角（turn）、α-螺旋（αhelix）、β-折疊（β-sheet）側鏈（side chain）和果膠（pectin）（圖3）。枝條1、枝條2 和枝條3 中蛋白質二級結構的種類及其比例如圖4 所示，對于同一組織而言，牡丹枝條1 中蛋白質的二級結構β +S+P（36.69%）>β（25.78%）>α（20.96%）>L+T（14.31%）>β +T（2.26%）；牡丹枝條2 中β +S+P（44.11%）>α（30.37%）>β（12.81%）>L+T（12.71%）>β+T（0%）；牡丹枝條3 中β+S+P（40.41%）>α（29.35%）>β（17.15%）>L+T（13.09%）>β+T（0%）。對于同一種蛋白質二級結構而言，β+S+P：枝條2>枝條3>枝條1；β：枝條1>枝條3>枝條2；α：枝條2>枝條3>枝條1；L+T：枝條1>枝條3>枝條2；β+T：枝條1>枝條2=枝條3；牡丹不同類型的枝條中所含蛋白質二級結構的共同點是α和β 結構所占比例之和所占比例最多（43%~47%），其次是β+S+P（36%~45%），再次是L+T（10%~15%），最少為β+T 的二級結構（0%~3%）。蛋白質二級結構所占比例與枝條的木質化程度存在一定關系：隨著木質化程度的降低（枝條1 到枝條2，再到枝條3），β+S+P 和α 均出現先增加后平穩的趨勢；β 呈先降低后平穩的趨勢；L+T 變化較為平穩。

表3 用于曲線擬合的枝條中蛋白質二級結構及波數

圖4 基于高斯多峰擬合分析枝條內蛋白質二級結構的百分比

3 小結與討論

牡丹的枝條按木質化程度不同，包括木質化程度最高的多年生枝條（枝條1）、木質化程度較高的一年生枝條（枝條2）、木質化程度較低的一年生枝條（枝條3）（圖1）。前人主要關注牡丹的莖結構與抗寒性關系以及不同發育時期莖中糖類物質的變化［26，27］。本研究借助FTIR 技術和高斯擬合分析方法重點研究枝條木質化程度與化學成分和分子構象的關系，從光譜學和蛋白質化學角度為解析牡丹枝條木質化程度的差異性提供理論基礎。

3.1 FTIR 解析鳳丹白不同木質化程度枝條的化學成分特性

FTIR 通過分子振動或轉動引起的偶極矩變化鑒定化合物的分子結構，也可用于物質的定量分析［28］。Lakshmi［29］利用FTIR 對防風草葉片中多種化合物進行了鑒定；Lahlali 等［9］借助FTIR 揭示了熱脅迫下豌豆花粉粒中脂質和蛋白質的變化規律；Chatjigakis 等［30］通過FTIR 技術研究了桃細胞壁上果膠的酯化程度。而本研究借助FTIR 技術詳細分析了不同類型枝條中特征化合物的種類及其變化規律，結果表明不同木質化程度的枝條在物質成分上存在較大差別。枝條1 的木質化程度高，所以木質素含量較其它類型枝條高（1 385 和1 461 cm-1）（圖2）。一年生枝條細胞分裂較快，單個植物細胞在生長過程中其體積可膨脹大約20 000 倍，因此細胞壁必須均勻協同生長，才能保持結構的完整性，以維持足夠的強度抵抗來自胞內5 個大氣壓的壓力并防止由于細胞壁局部缺陷造成的細胞“大出血”（細胞質外滲）［31，32］。細胞壁的主要組分包括纖維素、半纖維素和果膠［33］。纖維素在不同類型枝條中的含量變化不大，而與果膠相關的特征峰強度（3 420 cm-1）（表1）在一年生枝條中逐漸增強，且果膠的另一特征峰（1 410~1 450 cm-1）從枝條1 到枝條3 中發生紅移現象（表1），主要是因為果膠中COO-以單齒絡合方式與金屬離子結合時，其振動頻率將顯著低于游離的COO-［34］，因此，推測枝條3 細胞壁中果膠以單齒絡合的形式與金屬離子（如Ca2+）結合，從而促進細胞壁的有序自組裝，確保細胞壁的剛性和完整性。

3.2 枝條木質化程度與蛋白質二級結構的關系

植物體內行使調節功能的往往是蛋白質，為了進一步理解不同木質化程度枝條的蛋白質基礎，本研究對3 種類型枝條分別進行了氨基Ⅰ區域的曲線擬合分析，詳細調查不同類型枝條蛋白質二級結構的差異。總體來說，不同木質化程度的枝條均含有多種不同的蛋白質二級結構（圖4）。β-折疊+側鏈+果膠在枝條2 和3 中含量高于枝條1（圖4）。結合上述分析可知，木質化程度最低的枝條3 需要更多的果膠維持細胞快速分裂時細胞壁的完整性，推測與果膠相連的β-折疊結構能調控果膠在細胞壁結構中的自組裝過程。除此之外，α-螺旋在一年生枝條中的含量也高于多年生枝條（圖4），Lahlali 等［9］指出經高溫脅迫的豌豆花粉粒，其α-螺旋出現顯著下降，Wolkers 等［35］發現當香蒲花粉粒受到高溫脅迫時，α-螺旋也出現下降趨勢，這些研究提出降低α-螺旋結構的含量可以彌補因高溫引起的蛋白質-水之間氫鍵減少而造成的危害，從而抑制失水對植物造成的危害。據此推測，木質化程度高的多年生枝條1 比一年生枝條蛋白質α-螺旋結構的含量少，是由于枝條木質化升高后，細胞所含水分減少，蛋白質-水之間的氫鍵也隨之減少，鳳丹白主動調控降低蛋白質中α-螺旋結構的含量，減少木質化組織中因氫鍵缺失而對植株造成的危害。另外當體內的ATP（Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷）被修飾后（如ATP 與核酸反應），其結合能的改變會引起蛋白質二級結構構象的改變，如β-折疊和轉角結構會減少［36］。本研究發現枝條1 中β-折疊和轉角的二級結構較當年生新枝高，可以推測在木質化程度高的枝條中ATP 主要是以游離態存在，為植物生長提供能量基礎；而木質化程度較低的一年生新枝則利用ATP 進行物質代謝，為株系生長提供物質基礎。

鳳丹白枝條由多年生枝條（枝條1）和一年生枝條組成，一年生新枝又以頂芽為界分為木質化程度較高的下部枝條（枝條2）和木質化程度較低的上部枝條（枝條3）。枝條1 中含有較多的木質素，枝條2和3 細胞壁中含有較多的果膠，尤其是枝條3 中果膠上的羧基以單齒絡合方式與金屬離子結合，且存在許多與果膠相連的蛋白質，有助于植株主動調控細胞生長分裂時細胞壁的重新構建過程。枝條1 蛋白質的二級結構中α-螺旋含量較少，可以有效降低多年生枝條木質化組織中因蛋白質-水之間的氫鍵缺失而對植株造成的危害；枝條1 中含有較高的β-折疊和轉角，表明木質化程度高的多年生枝條中ATP主要是以游離態存在，可為植物生長提供能量基礎；枝條2 和枝條3 的蛋白質二級結構中含有較少的β-折疊和轉角，表明木質化程度低的枝條中ATP 已被修飾，利用ATP 合成了株系生長所需的物質，為植株生長提供物質基礎。