甘藍型油菜花粉粒ARTP 誘變及后代表型鑒定

何曉瑩，陸文虎，師偉策，王文敏，王敬喬，陳 葦，張國建，張建昆，束正齊，俎 峰

（1.云南省農業科學院經濟作物研究所，昆明 650205；2.昆明深洪生物科技開發有限公司，昆明 650051；3.云南省農業職業技術學院，昆明 650031）

甘藍型油菜大約起源于7 500 年前地中海地區甘藍和白菜的天然雜交與自然加倍［1］，其中油用甘藍型油菜的馴化與栽培僅有700 余年的歷史，是一個年輕的油料作物物種［2］。其有限的栽培馴化史與傳統的品種選育方法，尤其是20 世紀70 年代以來的雙低化育種導致其遺傳基礎相對狹窄，致使近年來甘藍型油菜突破性新品種選育困難，迫切需要創造新的優良種質材料，以拓展甘藍型油菜的遺傳基礎與優異基因庫［3］。

輻射與化學誘變是傳統的種質創新手段。其中輻射誘變多以X 射線、γ 射線、60Coγ 射線與宇宙射線作為輻射誘變源［4］，化學誘變多以EMS（甲基磺酸乙酯）為誘變劑［5］。前人利用這些傳統技術在甘藍型油菜中誘變獲得了高油酸［6，7］、高含油量［8］、長角果［9，10］、大粒［11］與矮桿［12］等優良突變體。但上述技術多具有人體與環境危害性，限制了其在生產上的大規模應用。基于大氣壓射頻輝光放電原理的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術是近年來興起的一種誘變新方法，具有成本低、安全簡便、對環境無害、突變率高、突變體遺傳穩定等優點［13，14］，前期已廣泛應用于各類微生物誘變優良菌株選育中［14-17］。近年來該技術逐漸應用到植物種質創新領域，研究報道顯示ARTP 誘變技術能夠提高金雞菊種子發芽勢與發芽率，增加幼苗葉片數量與葉面積，提升植株花朵的次生代謝產物［18］，促進玉米種子萌發與幼苗生長［19］，有助于提升甘蔗愈傷組織草甘膦抗性能力［20］，但未有ARTP 在油菜種質創新領域的應用研究報道。

本研究以甘藍型油菜花粉為誘變材料，采用ARTP誘變技術分別輻照0、20、30 和40 min，再將誘變后的花粉授于同一群體中自然產生的不育單株，探究不同輻照時間對誘變花粉授粉當代單角粒數及后代子粒發芽勢、發芽率、不育株率及含油量的影響。探索性地開展甘藍型油菜ARTP 花粉粒誘變試驗，以期獲得高含油量變異株系，并為今后生產上應用ARTP花粉粒誘變技術探索較為適宜的參數體系及為開展油菜種質創新提供新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜Ogu-CMS 恢復系16C 由云南省農業科學院經濟作物研究所油菜研究中心提供（16C外源恢復基因不完全符合孟德爾遺傳，純合可育單株自交后代群體中會自然產生約4% 的不育單株-16CS）。2018 年10 月種植16C 于尋甸基地網室；2019 年5 月收獲誘變花粉授粉后代-M0代種子；2019 年10 月種植M0代種子于小哨基地網室；2020年2 月田間調查4 個ARTP 輻照時間梯度后代群體不育株率并于2020 年5 月收獲M1代種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 ARTP 誘變 利用ARTP 誘變育種儀（ARTPP，無錫源清天木生物有限公司）使用99.99% 高純度氦氣作為工作氣體對油菜花粉粒進行輻照處理。輻照參數設置如下：額定功率，160 W；工作氣量，15 SLM；等離子發射源照射樣品距離，2 mm；輻照時間分別為0、20、30 和40 min，以CK、ARTP20、ARTP30和ARTP40 表示。

1.2.2 花粉取樣與誘變后授粉 2019 年1 月17 日，16C 盛花期選取當日開花的花朵，使用小毛刷仔細刷取花粉到誘變載盤，花粉厚度<1 mm。花粉粒ARTP 誘變后，誘變載盤置于冷藏柜（4 ℃）保存過夜。第2 天中午授粉于尋甸基地網室16C 群體中的不育單株-16CS（不育單株提前3 d 套袋，避免花粉污染）。每個輻照時間梯度花粉授粉5~10 株，2019年5 月收獲M0代種子。

1.2.3 M0代種子與植株測定指標及其方法 誘變花粉粒授粉當代植株單角粒數：每個輻照時間梯度選取5 個單株，每個單株選取主花序20 個角果進行單角果粒數統計。

M0代種子發芽勢與發芽率：把M0代種子播種在0.2% 瓊脂糖培養基上，室溫放置，分別統計第3 天和第6 天的萌發種子數，計算發芽勢與發芽率。重復3次，每個誘變時間梯度每重復播種100 粒種子。

發芽勢=（第3 天萌發種子數/每組試驗種子數）×100%

發芽率=（第6 天萌發種子數/每組試驗種子數）×100%

M0代植株不育株率調查：M0代植株盛花期，鑒定單株育性。

不育株率=（不育單株數/總單株數）×100%

1.2.4 M1代種子含油量測定 使用近紅外（NIRS）品質分析儀（FOSS5000，丹麥福斯公司）對M0代植株開放結實獲得的M1代種子進行含油量分析，具體操作參考前人報道［21］。

1.2.5 數據分析 數據采用均值±標準差表示。使用Excel 2016 進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 ARTP 輻照油菜花粉對當代授粉植株單角粒數的影響

用ARTP 輻照0、20、30 和40 min 的花粉給16CS植株授粉，單角粒數分別為29.74±0.90、29.13±1.54、23.95±2.02 與19.55±1.13。可見隨著ARTP 輻照時間增加，角粒數逐漸下降。其中ARTP20 處理的角粒數與對照（CK）相比基本沒有變化；ARTP40 授粉單角粒數最低，較CK 降低34.26%。方差分析結果見表1。由表1 可知，不同ARTP 輻照處理之間單角粒數差異極顯著（F值=53.88**），推測ARTP 輻照能夠顯著降低花粉粒活性和授粉結實能力，并進而影響角粒數。

表1 不同ARTP 輻照時間方差分析

2.2 ARTP 輻照油菜花粉對M0 代子粒發芽率與發芽勢的影響

M0代子粒3 重復發芽試驗結果見圖1。由圖1可知，CK、ARTP20、ARTP30 和ARTP40 誘變花粉授粉所得M0代子粒發芽勢分別為96.00%±1.00%、37.00%±2.65%、0.00%±0.00% 與13.67%±2.52%；發芽率分別為100%±0.00%、73.67%±3.79%、12.33%±3.06% 與27.67%±2.52%，表明ARTP 輻照顯著影響M0代子粒的發芽勢與發芽率。ARTP30 的M0代子粒發芽勢與發芽率最低，其中發芽勢低至0，而發芽率均值也僅有12.33%。但是，ARTP40 的M0代子粒發芽勢與發芽率較ARTP30 均有所上升，結合“2.1”結果，推測這可能是由于ARTP40 輻照誘變載盤上的花粉層厚度不均勻所致，雖然ARTP 輻照40 min 極大降低了花粉活力與授粉能力，但部分較厚花粉層底部的花粉粒未得到ARTP 充分輻照，進而導致其后代M0代子粒發芽勢與發芽率較ARTP30 有所提升。

圖1 M0代子粒發芽勢與發芽率

2.3 ARTP 輻照油菜花粉對M0代植株不育株率的影響

分別對CK、ARTP20、ARTP30 與ARTP40 的M0代植株取樣192、768、812 和837 株進行育性情況調查，其中不育株數分別為41、191、319 和265 株。ARTP20 的M0代不育株率為24.87%，比CK 不育株率（21.35%）略高；ARTP30 的M0代不育株率最高，達39.29%；ARTP40 的M0代不育株率次之，達31.66%（圖2）。由此可見，ARTP 輻照花粉時長≥30 min 顯著影響16C 花粉粒外源恢復基因的遺傳穩定性。但同時不同輻照時間梯度對不育株率的影響表現出與“2.2”類似的結果，即ARTP40 M0代植株不育株率低于ARTP30 M0代植株不育株率，推測亦是由于ARTP40誘變載盤上的花粉層厚度不均勻所致。

圖2 M0代植株不育株率統計

2.4 ARTP 輻照油菜花粉對M1代子粒含油量的影響

隨機收獲314 株ARTP30 和15 份CK 的M0代植株，利用近紅外品質儀對其M1代子粒進行含油量分析。結果顯示10 株CK M1代子粒含油量均值為41.39%±0.75%，與歷年來16C含油量均值41.17%±1.89%基本一致。而314株ARTP30 M1代子粒中含油量有287株超過42.50%、221株超過45.07%和43株超過50.20%，分別占比91.40%、70.38% 與13.69%；其中ARTP30-315 單株子粒含油量最高，達52.61%，較CK 含油量均值增幅27.11%。由此可見，ARTP30 的M1代油菜子粒含油量較CK 與16C 得到了顯著提升。

3 討論

本研究采用ARTP 誘變技術以4 個時間梯度（0、20、30、40 min）輻照油菜花粉，發現ARTP 輻照30 min 以上的誘變花粉，授粉當代單角粒數及后代M0代子粒發芽勢和發芽率均顯著下降，M0代植株不育株率顯著上升；同時發現ARTP30 M1代子粒含油量較CK 有顯著提升（43 份子粒含油量超過50.2%，占比13.69%），其中ARTP30-315 單株子粒含油量最高，達52.61%，較CK 含油量均值增幅27.11%。研究初步明確，利用ARTP-P 誘變儀開展甘藍型油菜花粉誘變較為適宜的ARTP 輻照時間區間，并獲得了大量含油量顯著提升的株系，為今后生產上應用ARTP 花粉粒誘變技術及開展油菜種質創新提供了有益的嘗試與技術參數借鑒。

較種子、幼胚及愈傷組織而言，花粉粒更適宜作為種質創新的誘變材料［5］。植物花粉量巨大，且花粉誘變產生突變后，通過雙受精作用能夠快速將遺傳變異傳遞給后代，但前人研究報道卻較少使用花粉作為誘變對象［4］。這主要是因為對于完全花作物而言，花粉誘變后授粉給原株系材料需要進行大量的人工剝蕾去雄；而授粉給不育系株系，則后代子粒基因型雜合，導致后續突變體與突變表型鑒定困難［22-25］。本研究采用Ogu-CMS 恢復系16C 作為花粉供體，其群體中自然產生的不育單株16CS 為誘變花粉授粉對象，既不需要大量手工剝蕾去雄，同時授粉后代的遺傳背景亦沒有發生改變，方便后續突變體與突變表型的比較與鑒定，較好地解決了上述問題。

甘藍型油菜Ogu-CMS 恢復系16C 為云南省主推雜交品種云油雜15 號父本，其在生產應用過程中存在兩個問題需要改良與解決。一是16C 含油量偏低，多年多點含油量測試均值在42% 左右，制約了云油雜15 號的產油量；二是恢復系16C 純合自交后代出現約4% 的不育單株，影響雜交制種產量與純度。本研究利用16C 花粉作為誘變材料，在輻照30 min 的后代中發現了43 份子粒含油量超過50.2%的單株材料，后續這些株系材料通過純化與篩選有望解決16C 含油量偏低的問題。同時本研究發現16C 為處理對照M0代不育株率為21.35%，這與16C純合自交后代4% 的不育株率一致。 ARTP 輻照30 min 以上，M0代植株不育株率顯著上升，最高達39.29%，表明16C 花粉外源恢復基因攜帶的染色體片段受到了ARTP 輻照的誘變，預示著有望在其后代中選育出育性遺傳更為穩定的恢復株系。未來研究中，需要進一步加強高含油量、育性更加穩定遺傳的突變材料的篩選，這樣的突變株系有望替代原有的16C 株系進行雜交種配制與生產。