云南干熱河谷區余甘子果實氨基酸組成及營養價值評價

袁建民，楊曉瓊，許智萍，孔維喜，趙瓊玲，雷 虓，何 璐*

(1.云南省農業科學院 熱區生態農業研究所，云南 元謀 651300；2.云南元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)又名滇橄欖、油甘子、印度醋栗、庵摩勒等，屬大戟科葉下珠屬植物，因其兼具食用和藥用價值而為大眾所熟知，廣泛分布于中國、印度、印度尼西亞和馬來西亞的熱帶、亞熱帶地區，其中，云南干熱河谷區余甘子野生資源十分豐富，位居全國首位，據估算，自然群落分布面積約為2萬hm2[1]。余甘子根、莖、葉、花、果實、種子均具有較高的藥用價值，而果實的應用最為常見，果實富含多種化學活性成分，包括氨基酸、維生素、蛋白質、碳水化合物、沒食子酸、綠原酸、鞣花酸、槲皮素、單寧、粘酸、生物堿、黃酮、酚苷、萜類等多種化合物，果汁中維生素C含量高達478.56 mg/100 mL，普遍高于柑橘、蘋果、石榴、葡萄等水果[2-3]。余甘子食用營養價值高之外，還具有極高的藥用價值，在傳統醫藥如中藥、藏藥和印度草藥中占有重要地位。據研究報道，余甘子單獨使用或者與其他傳統中藥聯合使用，可用于治療許多傳染性或者非傳染性疾病[2]，具有美白護膚[4]、降血糖和抗糖尿病[5]、保護肝臟[6]、抗病毒[7]、免疫調節和抗癌[8]、抗炎抗氧化[9]、保護神經作用[10]、治療呼吸系統疾病[2]等多種功效，故被收錄于多版《中國藥典》，被聯合國衛生組織指定為可在全世界推廣種植的保健植物。分析了不同種質余甘子果實中氨基酸含量及組成，同時評價其蛋白質營養價值，這對于優質余甘子品種選育、品質評價及綜合開發利用等具有重要意義。

氨基酸是蛋白質的重要組成單元，基于能否在人體中合成可分為必需氨基酸和非必需氨基酸，人體中的必需氨基酸只能從植物性食品中獲取。盡管動物性食品比植物性食品具有更高的營養價值，但是植物性食品生產所需的土地、能源等資源，以及產生的溫室氣體要少得多，因此，在全球人口日益增加的背景下，人們對植物性食品蛋白質的需求在不斷增加[11]。前人對余甘子氨基酸組成及其含量開展過一些研究。Barthakur等[12]采用鹽酸水解法研究發現余甘子鮮果中富含17種氨基酸，除了胱氨酸外，其他氨基酸濃度均高于蘋果，氨基酸總量為445.3 mg/100 g，但由于色氨酸被酸解破壞，未能檢測出。肖維強等[13]利用反相HPLC法測定了余甘子果實中的游離氨基酸的含量，結果共檢出9種游離氨基酸。趙瓊玲等[14]對來自云南和廣西的11份余甘子種質的鮮果總糖和氨基酸含量進行了分析評價，結果發現余甘子氨基酸含量豐富，平均含量為306.7 mg/100 g，變異系數為29.8%，與風味密切相關，可將供試余甘子種質分為3類。趙瓊玲等[15]還對霜凍前后余甘子鮮果中氨基酸、總酚、總酸、硒等功能成分的變化進行了研究，發現經霜凍后氨基酸含量顯著增加，品質和口感獲得改善。可見，氨基酸含量和組成對其品質的形成具有重要貢獻，是余甘子品質鑒定的重要指標之一，與其藥理作用同樣密切相關[2,3,7-8]。現有研究還表明，余甘子果實中氨基酸含量和組成受遺傳特性、土壤環境、氣候因素的共同影響，野生種與栽培種之間存在較大差異[1,15]。目前，關于余甘子氨基酸的深入研究仍然較缺乏，對余甘子氨基酸含量及其組成的研究也主要集中于廣東、福建、廣西、貴州等地的種質資源[13,16]，而對余甘子野生資源相當豐富的云南關注較少，且更多地局限于余甘子鮮果、果汁中氨基酸含量組分的測定評價，對云南干熱河谷區不同來源地不同類型余甘子果實干粉中氨基酸含量、組成及其蛋白質營養價值的綜合評價鮮見報道。

本研究利用全自動氨基酸分析儀對來自云南干熱河谷區元江縣、賓川縣、元謀縣等地的16份余甘子果實干粉中17種氨基酸含量進行了測定。采用基于氨基酸平衡理論設計的必需氨基酸比值系數法，對氨基酸組成及營養價值進行綜合評價，同時對各種質氨基酸含量進行因子分析評價，以期為余甘子種質資源的深入研究，以及余甘子資源新功能食品的開發利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 2018年12月上旬采集4個不同居群不同類型的余甘子種質成熟果實(表1)，分別為元江野生余甘子(YJYS)、元謀盈玉余甘子(YMYY)、賓川野生余甘子(BCYS)、熱農1號余甘子優良無性系(BCJY)，每個材料選取3～5株，每株均在東、南、西、北共4個方向進行隨機采集，其成熟度、大小相對一致，果形端正，無病蟲害，每株采集約500 g，作為1個混合樣，記錄好采樣時間、采樣地點等數據帶回實驗室。室內試驗在云南省農業科學院熱區生態農業研究所干熱河谷農業生態實驗室進行。將供試余甘子鮮果用超純水洗凈，測定果實性狀數據，去核后的果肉于60 ℃條件下烘至恒重，研磨機粉碎后過0.25 mm孔徑的過濾篩，混勻后密封干燥保存，備用。

表1 供試余甘子種質及其來源

1.1.2 試劑 色譜級甲醇(由德國默克公司生產)；優級純濃鹽酸(由重慶川東化工有限公司生產)；檸檬酸緩沖液A(pH值3.45)、檸檬酸緩沖液B(pH值10.85)、再生液D、樣品稀釋液(pH值2.20)、茚三酮、還原劑維生素C、鉀鈉緩沖液、17種氨基酸混合溶液標準品(2.5 μmol/mL，胱氨酸減半)，均購自德國賽卡姆(北京)科學儀器有限公司；氮氣(純度≥99.999%)；所有試驗過程用水均為超純水(電阻率≥18.25 MΩ·cm)。

1.1.3 主要儀器設備 Sykam-433D型全自動氨基酸分析儀(由德國賽卡姆公司生產)；GZX-9140MBE型恒溫干燥箱(由上海博訊公司生產)；LC-DCY-24G型干式氮吹儀(由上海力辰科技有限公司生產)；UPH-IV-20T型超純水儀(由中國優普公司生產)；Vortex-M渦旋混勻儀(由上海滬析公司生產)；萬分之一電子分析天平ATX224(由日本島津公司生產)；移液槍RAININ(由美國瑞寧公司生產)；行星式球磨機QM3SP(由南京馳順公司生產)。

1.2 試驗方法

1.2.1 氨基酸含量的測定 本研究主要測定水解氨基酸含量，參照GB/T 5009.124─2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》的方法，對余甘子成熟期果肉(干粉)中的17種氨基酸進行水解提取，利用全自動氨基酸分析儀進行定量分析。具體步驟為：準確稱取固體樣品0.2 g，置于厭氧水解管底部，加入10.0 mL 6 mol/L鹽酸，輕輕混勻，充氮氣狀態下進行封管；將已封口的水解管置于110 ℃恒溫干燥箱內水解24 h，取出冷卻至室溫，打開水解管定容至50 mL，再用0.45 μm濾膜過濾保存于離心管，震蕩混勻。根據預試驗結果調整樣品的稀釋倍數，確保色譜峰的大小合適，不出現禿峰。吸取0.5 mL濾液于2.0 mL離心管中，置于氮吹儀60 ℃條件下干燥，殘留物再復溶2～3次，保證濃鹽酸揮發干凈，樣品充分干燥；最后加入1.0 mL pH值2.2的樣品稀釋液溶解，混勻，0.45 μm濾膜過濾；樣品提取后置于2.0 mL棕色樣品瓶中，盡快放入氨基酸分析儀中進行分析，標準氨基酸溶液和樣品溶液均以相同體積注入氨基酸分析儀，標準品濃度100 nmol/mL，進樣量0.05 mL，以外標法進行測定。

測定條件如下：色譜柱(LCA K06/Na，磺酸基強酸性陽離子交換樹脂，4.6 mm×150 mm長柱，7 μm填料)；洗脫泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min；泵壓3.0～4.0 kPa，柱溫58～74 ℃梯度控溫；反應器溫度130 ℃；570 nm和440 nm(脯氨酸)雙通道進行檢測；分析時間45 min；氮氣壓力0.5～0.6 kPa。

1.2.2 氨基酸營養價值的評價 氨基酸平衡理論認為，食物中蛋白質的氨基酸組成與人體蛋白質組成越接近，同時可被人體吸收時，其營養價值才越高。氨基酸含量的變化會影響到其他氨基酸的利用價值，進而降低食品中蛋白質營養價值。本研究4種余甘子果肉中氨基酸營養價值的評價方法，參照朱圣陶等[17]和1973年WHO/FAO[18]提出的方法進行評價，涉及以下指標：氨基酸得分(Amino Acid Score,AAS)、氨基酸比值系數(Ratio Coefficient,RC)、比值系數分(Score of RC,SRC)。各指標計算公式為：

氨基酸得分(AAS)=參試樣品中氨基酸含量/參考模式氨基酸含量

氨基酸比值系數(RC)=某一種氨基酸得分/氨基酸得分均值

比值系數分(SRC)=100×(1-CV)

式中，CV是RC的變異系數，CV=標準差/氨基酸得分均值。

式中，EAAI為必需氨基酸指數；n為被比較的必需氨基酸個數，n≤8；an為供試樣品中必需氨基酸含量；bn為FAO/WHO評分模式中與an相對應的標準蛋白質必需氨基酸含量。

另外，必需氨基酸中AAS最低的氨基酸被認為是第一限制性氨基酸。

1.3 數據處理

采用Excel 2003軟件對所有原始數據進行初步整理，氨基酸含量以“平均值±標準差”來表示。利用SPSS 20.0軟件的ANOVA對數據進行差異顯著性分析，各樣品間的多重比較采用LSD法進行，差異顯著性水平為α=0.05。因子分析首先對數據進行標準化處理，采用主成分法提取公因子，采用最大方差法進行因子旋轉，計算因子得分及排名，輸出因子載荷圖。

2 結果與分析

2.1 不同來源余甘子果實中氨基酸含量的差異性

本試驗獲得的標準氨基酸色譜圖和樣品色譜圖效果均較好，17種標準氨基酸和樣品氨基酸均得到了較好的分離，峰面積適宜。除了甲硫氨酸(Met)未出峰以及胱氨酸(Cys)峰較小之外，其余15種氨基酸的峰面積均較大，分離度較好。

供試余甘子果實中氨基酸的組成與含量分析結果表明(表2)，余甘子果實中氨基酸種類較齊全，YJYS、YMYY和BCYS中均含有16種氨基酸(Met未檢出)，BCJY中含有15種氨基酸(Cys和Met均未檢出)，氨基酸含量范圍為2.17%～2.84%。不同類型不同來源的余甘子果實總氨基酸含量及氨基酸組成存在顯著差異(P<0.05)，BCJY的氨基酸總量最高。其次是YMYY和BCYS，兩者差異性不顯著，氨基酸總量高低順序為BCJY>YMYY≈BCYS>YJYS，且表現為栽培種(2.70%)>野生種(2.35%)。BCJY、BCYS和YJYS氨基酸含量前3位均為谷氨酸、脯氨酸、天門冬氨酸，分別占氨基酸總量的53.87%、39.68%和35.02%；而YMYY中排前3位的是谷氨酸、脯氨酸、精氨酸，占氨基酸總量的46.48%。

表2 4種余甘子果實水解氨基酸的組成及其含量

從變異系數來看，排前3位的氨基酸依次是胱氨酸、谷氨酸、精氨酸，變異系數依次為81.60%、52.96%、45.04%。胱氨酸僅在BCJY中未被檢出，其余3份種質中均有檢出，但含量均較低。不同種質余甘子果實中含量最高的氨基酸是谷氨酸，表現為BCJY中含量最高，達1.02%，顯著高于其他種質，是其他種質的2～3倍。此外，精氨酸在YMYY中的含量較高，達0.28%，顯著高于其他種質，約為其他種質的2倍。

2.2 不同來源余甘子果實中氨基酸組成的差異性

各種質余甘子果實中各組分氨基酸含量見表3。由表3可知，不同余甘子種質果實中各組分的氨基酸含量存在較大差異。兒童必需氨基酸含量范圍為0.25%～0.44%，表現為YMYY>BCJY>BCYS>YJYS；人體必需氨基酸總量則表現為：YJYS>BCYS>YMYY>BCJY，占氨基酸總量的比值為0.20～0.31，表現為野生種高于栽培種；而非必需氨基酸占比在不同種質間則正好相反。在味覺氨基酸方面，鮮味氨基酸含量依次為BCJY>YMYY>YJYS>BCYS，占比為0.26～0.44；甜味氨基酸表現為BCYS>YMYY>YJYS>BC，占比為0.28～0.44；苦味氨基酸含量為YMYY>YJYS>BCYS>BCJY，且BCJY的苦味氨基酸占比最低，說明BCJY種質與其他材料相比，有更好的口感，與先前的果實口感評價相一致。芳香族氨基酸具有賦予食品特殊風味的作用，是一類具有芳香環的氨基酸。

表3 4種余甘子果實各組分氨基酸的比較 %

供試余甘子果實芳香族氨基酸含量總體較低，其范圍0.13%～0.19%，占比為0.04～0.07。藥用氨基酸是維持人體氮平衡的必需物質，在食物營養中占有重要地位和作用。藥用氨基酸含量范圍為1.27%～1.81%，其中以BCYJ含量最高，其次是YMYY，表現為栽培種高于野生種，其保健效果可能更好。

支鏈氨基酸可以刺激胰島素和生長激素的釋放，促進物質合成代謝，食物中支鏈氨基酸有助于增加肌肉質量。支鏈氨基酸含量依次為BCYS>YJYS>BCJY>YMYY，范圍0.31%～0.39%，表現為野生種高于栽培種。氨基酸因其側鏈R基團的結構和極性決定著氨基酸的酸堿性特征，氨基酸酸堿性不同其性質及功能截然不同。供試余甘子果實中中性氨基酸含量范圍為1.14%～1.44%，以BCYS最高，占比為0.40～0.57；酸性氨基酸含量范圍為0.57%～1.24%，BCJY最高，占比(0.44)也最高，明顯高于其他種質；堿性氨基酸含量范圍0.44%～0.58%，YMYY最高。

2.3 不同來源余甘子果實中氨基酸的比值系數法評價

不同種質中必需氨基酸組成比例及FAO/WHO提出的模式蛋白質標準比較結果見表4。由表4可知，各種質余甘子果實的纈氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸、賴氨酸均高于氨基酸模式譜(WHO/FAO)，而蘇氨酸、甲硫氨酸+胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等氨基酸則低于氨基酸模式譜，其中甲硫氨酸+胱氨酸含量最低。

表4 4種余甘子果實必需氨基酸的組成比例 %

4種余甘子果實必需氨基酸的AAS、RC、SRC和EAAI分析結果見表5。由表5可知，4種余甘子果實氨基酸比值系數分(SRC值)高低順序為YJYS>YMYY>BCYS>BCJY，范圍為49.79～61.46，元江野生余甘子(YJYS)的SRC值最高，為61.46。根據氨基酸平衡理論，認為SRC值越接近100，植物蛋白質的營養價值越高，因此，YJYS的營養價值最高。在各種必需氨基酸中，甲硫氨酸+胱氨酸的AAS值和RC值均最小，AAS值為0.00～0.20，RC值為0.00～0.23，RC值低于1，說明甲硫氨酸+胱氨酸是余甘子果實的第一限制性氨基酸。此外，異亮氨酸的RC值也均低于1，說明余甘子果實中異亮氨酸相對不足；蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸、賴氨酸等氨基酸的RC值大于1，說明這些氨基酸相對過剩。根據EAAI指數評價標準，EAAI越接近于1，說明該植物蛋白與標準蛋白必需氨基酸組成越是接近，其營養價值越高。

表5 4種余甘子果實必需氨基酸的AAS、RC、SRC和EAAI指數比較

本研究中4種余甘子果實EAAI指數范圍為0.64～0.85，其中YJYS最接近于1，說明YJYS余甘子果實營養價值較高，屬于較好的植物蛋白源。

2.4 不同來源余甘子果實中氨基酸因子的分析及綜合評價

對不同來源的余甘子果實中17種氨基酸進行主成分提取的因子分析，結果顯示(圖1、表6)：共提取2個主成分，累計貢獻率達85.46%，可反映供試樣品中氨基酸含量的絕大部分信息。其中，第1主成分(PC1)的方差貢獻率為60.28%，代表性氨基酸主要是賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、苯丙氨酸(Phe)；第2主成分(PC2)的方差貢獻率為25.17%，代表性氨基酸主要是纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、異亮氨酸(Ile)、天門冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)。

圖1 各氨基酸主成分散點圖

表6 主成分因子分析結果

通過旋轉后的因子載荷矩陣結果(表7)中公因子F1和F2可以代替原來的17種氨基酸指標進行綜合評價，根據特征值及其方差貢獻率的權重可建立以下評價模型，即F=0.71F1+0.0.29F2，計算出各種質的因子得分、綜合得分及排名(表8)。由結果可知，第1主成分和第2主成分中賓川野生余甘子(BCYS)得分最高，其次是元江野生余甘子(YJYS)，進一步分析發現第1主成分和第2主成分因子載荷較大的指標主要是必需氨基酸(圖1)，因此，從主成分分析結果可以得出，賓川野生余甘子(BCYS)中必需氨基酸得分較高。因子分析的綜合得分結果顯示賓川野生余甘子(BCYS)排名第1，其次是元江野生余甘子(YJYS)。

表7 旋轉后的因子載荷矩陣

表8 因子分析的綜合得分與排名

3 討論與結論

隨著世界人口的不斷增長、社會人口結構的變化等因素，食物類型多樣化的需求導致的資源壓力不斷加劇。動物源性蛋白質需求的增加可能會對環境造成不良影響，如產生溫室氣體排放，需要更多的水和土地[11]。植物性蛋白質源含有豐富的氨基酸，是重要的蛋白質可替代源，因此研究植物性食品中氨基酸含量及組成具有重要意義。氨基酸是構成蛋白質的基本單元，特別是必需氨基酸，只能從食物中獲取，以便維持人體的正常生命活動。因此，氨基酸含量及組成是衡量余甘子品質的重要指標。

本研究表明：4份余甘子種質果實中氨基酸種類較齊全，大部分含有16種氨基酸，氨基酸總量為2.17%～2.84%(干重)，其中來自賓川的BCJY氨基酸含量最高，達2.84%，高于無花果(0.37%～0.81%干重)[19]、酸角(1.75%～2.23%干重)，與刺梨(3.05%～5.22%干重)[20]較為接近。谷氨酸、脯氨酸、天門冬氨酸等含量較高，谷氨酸是人體新陳代謝的重要氨基酸，比其他氨基酸參與更多的代謝反應，是葡萄糖的重要來源，也是肌肉和其他細胞的重要組分，可作為表面活性劑、緩沖劑、螯合劑、增味劑、培養基等，具有免疫、神經傳導、抗癌、保護肝臟等多種作用[21]。脯氨酸具有合成膠原蛋白、維持人體氮平衡、修復牙釉質等作用。天門冬氨酸可調節腦和神經代謝，保護肝臟，消除疲勞，廣泛用于醫藥、食品和化工等領域。因此，余甘子可作為開發功能性食品的優質來源。此外，本研究發現，不同余甘子種質中氨基酸總量及各氨基酸含量差異顯著，其中胱氨酸、谷氨酸、精氨酸的變異系數排前3位，氨基酸總量表現為栽培品種高于野生品種，這可能與品種遺傳特性及栽培環境等因素有關。值得關注的是YMYY種質中精氨酸含量明顯高于其他種質，精氨酸在傷口愈合、抑制腫瘤、改善消化、心血管疾病、肺功能、生殖功能等方面發揮重要作用[22-23]。可見，開發余甘子功能性食品時，還應根據種質特性進行合理利用。

目前，有研究認為，對成人而言必需氨基酸共有8種，分別為蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、色氨酸、賴氨酸，缺乏任何一種，人體的正常生命代謝就會發生障礙，可導致各種疾病發生甚至生命活動終止。本研究4種余甘子果實中7種必需氨基酸齊全(甲硫氨酸均未檢出)，占氨基酸總量的19.8%～31.3%，與橄欖(24.13%～25.80%)[24]、楊梅(28.2%～35.2%)[25]、覆盆子(29.95%)[26]、刺梨(39.54%)[27]等相當。余甘子作為傳統的中藥材和藥食同源功能性植物，因其藥用潛力巨大而備受關注。余甘子果實中富含多種藥用氨基酸，占氨基酸總量的56.4%～63.5%，以谷氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、亮氨酸、賴氨酸為主，這與石斛(63.79%)[28]、烏飯樹果實(61.70%)[29]、枸杞(63.63%～71.41%)[30]、黨參(70.0%)[31]等藥用氨基酸占比相接近。4份余甘子鮮味氨基酸占氨基酸總量的25.6%～43.6%，來自賓川的余甘子種質BCYJ(43.6%)其鮮味氨基酸含量明顯高于其他種質，與橄欖(45.85%～50.80%)[24]相接近，這可能是其口感確實優于其他種質的原因。以上說明余甘子果實不僅具有較好的口感風味，其保健和藥用價值也較高。

氨基酸比值系數法是基于氨基酸平衡理論提出的蛋白質營養價值評價方法，其中氨基酸比值系數(RC)和比值系數分(SRC)是2個重要的衡量指標。RC值越集中，說明氨基酸在其平衡上做的負貢獻越小，變異系數越小，SRC值則越大，蛋白質營養價值則越高。本研究對4份余甘子種質必需氨基酸的AAS、RC和SRC進行了細致分析，結果表明：4種余甘子中必需氨基酸的營養相對較為均衡，除了甲硫氨酸+胱氨酸的AAS值較小外，其余必需氨基酸的AAS值均在1左右，這與1973年WHO/FAO提出的人體蛋白質參考模式相近，余甘子果實SRC值為49.79～61.46，EAAI指數為0.64～0.85，其中元江(YJYS)野生余甘子果實的營養價值最高，營養較均衡，高于楊梅(49.32～57.83)[25]、無籽刺梨(59.22)[27]、石斛(41.48～58.73)[28]，但低于黨參(73.35)。結果顯示，甲硫氨酸+胱氨酸是余甘子果實的第一限制性氨基酸，建議在食用過程中，可與牛奶、雞蛋等動物蛋白相結合，以提高其營養價值。本研究供試的余甘子種質數量較少，采樣量和采樣范圍有限，今后有必要針對不同采發育時期、氣候條件、栽培模式，研究其氨基酸含量及組成變化規律，明確余甘子中氨基酸對環境因子的響應特征，為全面合理評價余甘子資源及其綜合開發利用提供更多的依據。