蛹蟲草淺層發酵產蟲草素培養基優化

鄒亞男，劉慶國，王松濤，趙 南，陳 勇，應漢杰

(1.南京高新工大生物技術研究院有限公司,江蘇 南京 210061；2.瀘州品創科技有限公司,四川 瀘州 646099；3.南京工業大學,江蘇 南京 211816)

近年來的研究證實了蛹蟲草的活性物質明顯高于冬蟲夏草，可以作為冬蟲夏草的替代品[1-2]。現代科學論證蛹蟲草不僅具有特殊的營養價值，而且有明顯的藥用價值,其中尤以蟲草素活性物質的藥用價值最為顯著[3]。

目前，蟲草素合成方法主要有化學合成法和生物發酵法2種。化學合成工藝復雜，產物回收率低，生產成本高；而生物發酵法是通過蛹蟲草發酵獲得，方法簡單，反應條件溫和，易于工業化生產。不同研究者通過培養基配方優化等以獲得高產蟲草素的培養條件或蛹蟲草菌株[4-6]。文庭池等[7]考察了蛹蟲草菌株在通過光照振蕩、光照靜置、黑暗振蕩、黑暗靜置4種培養方式和添加前體物質，發酵60 d后，發酵液內蟲草素和腺嘌呤含量變化，結果表明:CM3菌株在靜止培養及添加前體時蟲草素的含量達2.54 g/L，腺嘌呤利用率達99.79%。荊留萍等[8]研究了不同前體物及營養物對蛹蟲草液體發酵中蟲草素和蟲草多糖含量的影響，結果顯示：腺苷、核糖、谷氨酰胺、甘氨酸均能明顯提高蟲草素及蟲草多糖的含量，其最適添加量分別為4、2～3，0.5～1.0、0.5 g/L。Shih等[9]以蛹蟲草CCRC 32219為研究對象，考察了初始pH值、不同氮源、植物油和培養方式(搖瓶和靜態培養)對蟲草生物量和蟲草素產量的影響，結果表明：酵母提取物和玉米浸漬粉對蟲草素合成有顯著提升作用，并且C/N比低也有利于蟲草素的生產，植物油可以促進蛹蟲草的菌絲生長，但對蟲草素的產生影響不大，在最佳條件下，蟲草素的最大產量為2.2 g/L。

筆者分析了不同碳源、前體物質及微量元素等對蟲草素發酵的影響，以期找到提高蟲草素含量的發酵途徑，為蟲草素研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株C.militarisCGMCC18581由C.militarisCICC14014經物理化學復合誘變所得，保藏于南京高新工大生物技術研究院(CY1909)與中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.1.2 試劑 葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉均采購于國藥集團化學試劑有限公司；酵母蛋白胨、安琪酵母粉均采購于市場；蛋白胨和酵母粉均為OXOID；腺嘌呤、腺苷、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸均采購于上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養基 (1)固體培養基：土豆200 g煮沸過濾取汁，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B1 0.1 g，瓊脂15 g，定容至1 L，pH值自然。

(2)種子培養基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氫鉀0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，pH值5.8。

(3)發酵基礎培養基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氫鉀0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，吐溫-80 0.5 g/L，腺嘌呤4 g/L，pH值5.8。

1.2 儀器與設備

SX-700立式全自動滅菌鍋(由TOMY公司生產)；ZQZY-CF震蕩培養箱(由上海知楚儀器有限公司生產)；SW-CJ-1BU超凈工作臺(由蘇州安泰空氣技術有限公司生產)；GENESYS 10S UV-Vis紫外可見分光光度計；Agilent1260高效液相色譜儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株培養條件 (1)斜面菌株培養：將試驗室保藏的蛹蟲草菌株轉接至固體培養基，25 ℃恒溫培養5～7 d，獲得斜面菌種。

(2)種子培養：刮取培養好的斜面菌絲體接種至裝有200 mL種子培養基的1 L三角瓶中，25 ℃，180 r/min恒溫震蕩培養3～4 d。

(3)發酵培養：按10%接種量接種至裝有200 mL發酵培養基的1 L三角搖瓶中，25 ℃下靜置發酵3～4周。

1.3.2 氮源優化試驗 采用不同品牌的蛋白胨、酵母粉進行氮源優化，按總氮量換算廉價氮源的添加量。具體配方見表1。

表1 不同氮源組合

1.3.3 單因素優化 (1)單因素優化試驗。金屬離子為MnSO4、ZnSO4、CuSO4、CaSO4、FeSO4，濃度0.04 g/L；前體物質為腺嘌呤、甘氨酸組合優化試驗。

(2)單因素爬坡試驗。將最適蛋白胨質量濃度調至30～50 g/L，最適酵母粉的質量濃度調至3～20 g/L，微量元素質量濃度調至0.02～0.14 g/L。

1.3.4 響應面設計試驗 根據單因素爬坡試驗結果,對蛋白胨、酵母粉、硫酸亞鐵和前體物質4個因素進行Box-Benhnken試驗，每個因素取3個水平，響應值為蟲草素產量，具體試驗設計見表2。

表2 響應面試驗設計 g/L

1.4 樣品檢測方法

1.4.1 蟲草素檢測 取發酵液，10000 r/min離心10 min。上清液用容量瓶稀釋20倍后，經0.22 μm濾膜過濾，得到待測樣品液。采用液相色譜法測定蟲草素含量。

高效液相色譜條件：色譜柱Sepax HP-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，120?；檢測器：紫外線，波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇∶磷酸二氫鉀=25∶75；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。根據色譜峰保留時間進行定性分析，以外標峰面積法進行定量分析。

1.4.2 總氮檢測方法 采用全自動凱氏定氮儀K9860檢測。

1.4.3 氨基酸檢測 參照白嵐[10]的研究文獻。

1.4.4 數據處理方法 采用Origin 8.1軟件進行數據統計分析和作圖。Box-Behnken響應面設計采用Design Expert軟件。

2 結果與分析

2.1 氮源優化

由圖1所示，編號1、3、9蟲草素產量較高，其中編號1為OXOID的蛋白胨和酵母粉，成本較高，不采用；而編號3為信和酵母蛋白胨和編號9安琪酵母粉FM139分別是相對較佳的蛋白胨和酵母粉。

圖1 不同氮源組合對蟲草素發酵的影響

從表3可知，在2種配方中，各氨基酸成分較為一致，且谷氨酸、天冬氨酸含量較高，該結果說明2種配方相似組分保證了發酵效果的一致性。

表3 2種氮源組合下培養基中各氨基酸濃度 g/L

2.2 微量元素優化

由圖2可以看出，Mn2+、Cu2+、和Ca2+對蟲草素合成無明顯作用，甚至有一定的抑制作用；Zn2+對蟲草素產量提高有一定的促進影響，但效果不顯著。而添加少量Fe2+可以顯著提升蟲草素的積累量。

圖2 不同金屬離子濃度對蟲草素產量的影響

2.3 前體物質優化

由表4可知，在不加腺嘌呤條件下，蟲草素產量隨著甘氨酸添加量的提高而提高，將甘氨酸濃度提高至12 g/L以上，對蟲草素產量提高的貢獻度較低。在添加2 g/L的腺嘌呤后，蟲草素產量提高顯著，甘氨酸濃度達8 g/L以上時，蟲草素提高不明顯。另外，當添加4 g/L的腺嘌呤條件下，甘氨酸從0提高到8 g/L，蟲草素產量同樣提高不顯著。由于腺嘌呤價格遠高于甘氨酸，結合發酵的效果，將腺嘌呤和甘氨酸添加量分別設定為2和8 g/L。

表4 不同腺嘌呤和甘氨酸組合對蟲草素產量的影響

2.4 單因素爬坡試驗

分別選擇單因素試驗中發酵效果最好的廉價氮源(信和酵母蛋白胨、安琪酵母粉)和金屬離子(硫酸亞鐵)進行爬坡試驗(圖3)。當信和酵母蛋白胨、安琪酵母粉、硫酸亞鐵濃度分別采用45 g/L、7 g/L、0.08 g/L時，蟲草素的產量最高。

圖3 氮源和金屬離子對蟲草素產量的影響

2.5 響應面優化設計

使用爬坡試驗中獲得的各因子對應的蟲草素產量最高點為中心進行響應面設計并開展試驗，以蛋白胨、酵母粉、硫酸亞鐵、腺嘌呤/谷氨酸為自變量，以蟲草素含量(Y)為響應值，其方案與結果見表5。蟲草素產量與自變量之間的回歸方程達極顯著水平(P<0.0001)，失擬項P=0.1770不顯著，表明失擬項影響效果較小，模擬的擬合程度較好[11]。由此表明該模型建立成功，并可以利用該模型對蟲草素產量進行分析及預測。利用Desigin-Expert 8.0.6 軟件對數據進行擬合，得到其回歸方程：Y=-4.62+0.15A+0.54B+51.98C+0.60D-0.0013AB-0.25AC+0.0023AD-0.80BC-0.019BD-0.31CD-0.0013A2-0.022B2-249.22C2+0.14D2。

表5 響應面試驗結果分析

利用軟件計算分析優化得到4個因素的最佳質量濃度為信和酵母蛋白胨52.25 g/L，利用軟件計算分析優化得到4個因素的最佳質量濃度分別為信和酵母蛋白胨52.25 g/L、安琪酵母粉8.43 g/L、硫酸亞鐵0.06 g/L、腺嘌呤3 g/L+甘氨酸12 g/L。在該方程模擬預測下的蟲草素產量為6.21 g/L，在此條件下進行驗證，測得蟲草素產量6.35 g/L，與預測的產量相差2.25%。此外，該4個因素在發酵過程中的相互作用分析見圖4。

圖4 不同變量交互作用對蟲草素產量的影響曲面圖

3 討論與結論

本試驗首先通過對不同氮源以高產蟲草素為指標進行篩選，最終確定有效提高蟲草素產量的為信和蛋白胨和安琪酵母粉。通過氨基酸組分分析，這2種氮源與價格昂貴的OXOID蛋白胨和酵母粉組分相似,且谷氨酸含量均較豐富。有研究表明，谷氨酰胺物能大幅提高蛹蟲草液體發酵胞外蟲草素的產量[12-14],而谷氨酸是谷氨酰胺的前體物質，故對蟲草素合成也有明顯促進效果。

根據報道表明，腺苷是蟲草菌素的直接前體，腺嘌呤又是腺苷的前體，故腺嘌呤對蟲草素合成有明顯的正向調控作用[15-17]。甘氨酸與蟲草素沒有直接的關聯，但可能影響蟲草素前體物質的合成。因為本試驗在沒有添加腺嘌呤和其他前體物質條件下，添加適量甘氨酸，蟲草素產量有顯著提高。本試驗篩選的最優添加方式是2 g/L的腺嘌呤和8 g/L的甘氨酸組合。2種前體及營養物能夠通過協同互補作用提高胞外蟲草素的產量,這與文庭池等[18]研究的結果較為一致。

表6 回歸模型方差分析

另外，根據葉晶晶等對1株蛹蟲草DY-1菌株進行液體發酵配方優化研究結果，發現鐵離子對菌絲體生長有顯著促進作用，而蟲草素產量與菌體生長量呈正相關[19]。研究表明，硫酸亞鐵能調節基因轉錄水平，從而提高蟲草素合成[20]}。本試驗結果顯示：FeSO4低濃度對蟲草素積累量的影響較大，這與秦鵬等的研究結果相近[21]。

綜上所述，本研究為蛹蟲草發酵產蟲草素供了一組最優的發酵配方，最佳配方為：信和酵母蛋白胨52.25 g/L、安琪酵母粉8.43 g/L、硫酸亞鐵0.06 g/L、腺嘌呤3 g/L+甘氨酸12 g/L。在此條件下進行驗證，測得蟲草素產量6.35 g/L，與預測的產量相差2.25%。該發酵優化結果為后續放大發酵和應用研究奠定了基礎。