基質固相分散-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留

宋磊

摘 要：目的：建立雞蛋中氟蟲腈及代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。方法：在QuEChERS方法基礎上，對提取溶液、鹽析劑和凈化劑等參數進行了優化。最終，樣品以乙腈水提取，C18凈化，UPLC-MS/MS測定。結果：氟蟲腈及其代謝物在10～100 ng/mL范圍內線性關系較好，相關系數r≥0.995，以3倍和10倍信噪比計算氟蟲腈及其代謝物的檢出限和定量限分別為0.162～0.685 ?g/kg和0.541～2.285 ?g/kg。在雞蛋空白樣品添加濃度為0.02 mg/kg水平下，氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟甲腈、氟蟲腈硫醚回收率范圍為78.0%～107.4%，相對標準偏差（RSD）為3.93%～5.66%。結論：本方法快速、簡便、準確，可用于雞蛋中的氟蟲腈及其代謝物殘留的測定。

關鍵詞：基質固相分散;超高效液相色譜-串聯質譜;氟蟲腈;雞蛋

雞蛋蛋黃中的卵磷脂、甘油三酯、膽固醇和卵黃素對神經系統和身體發育有益，還能改善記憶力，雞蛋中的蛋白質能夠修復肝臟組織損傷[1]。在養殖過程中，獸藥能預防和治療疾病，這些藥物在使用過程中會直接或間接地進入雞體內，對人體健康產生影響。氟蟲腈主要用于防治多種害蟲[2]，但是氟蟲腈會對生態環境和人體健康造成影響，所以我國規定2009年10月1日起禁用氟蟲腈[3]。

QuEChERS法具有快速、簡便、廉價、有效、耐用、安全，是近年來應用日趨廣泛的萃取技術，已被逐步用于獸藥殘留檢測領域[4-5]。氟蟲腈類藥物的測定方法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-串聯質譜法等。UPLC-MS/MS在獸藥殘留檢測方面具有強的定性和定量分析能力，廣泛應用于農藥和獸藥殘留的檢測[6-8]。本研究通過試驗探究QuEChERS方法結合UPLC-MS/MS檢測雞蛋中氟蟲腈類抗菌藥物殘留的試驗條件，建立了一種快速、有效、簡便的測定雞蛋中氟蟲腈類藥物的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：乙腈、甲酸、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）;實驗室用水為Milli-Q超純水;無水硫酸鎂、氯化鈉（徐州淞譽化工科技有限公司）;C18購買于美國Waters公司;氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟甲腈和氟蟲腈硫醚標準品溶液（100 ?g/mL）（北京壇墨質檢科技有限公司）。

儀器：Waters TQ MS超高效液相串聯質譜儀（美國Waters公司）;HC-3515高速離心機（日本日立公司）;Milli-Q超純水凈儀（美國密理博公司）;KQ-500V數控超聲波清洗器;數顯渦旋振蕩器（美國賽默飛公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

（1）混合標準儲備液。分別吸取標準品溶液氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟甲腈、氟蟲腈硫醚1 mL至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配成濃度為10 ?g/mL的標準儲備液。

（2）混合標準中間液。準確吸取混合標準儲備液，用甲醇定容配成濃度為1.0 ?g/mL的混合標準中間液。

（3）溶劑和基質標準溶液的配制。準確吸取適量混合標準中間液，濃度為1.0 ?g/mL，用流動相初始比例逐級稀釋成質量濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的溶劑混合標準溶液，基質標準溶液按照相同系列濃度配制。

1.2.2 樣品前處理

稱取雞蛋樣品2.00 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈/水（9∶1，V/V）（含0.5%甲酸）作為提取溶劑，旋渦振蕩均勻，加入1 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈振蕩3 min，超聲提取10 min，4 ℃條件下，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液加入含有10 mg C18凈化管中，手動劇烈振蕩3 min，4 ℃條件下，10 000 r/min離心5 min，0.22 ?m濾膜過濾后，UPLC-MS/MS檢測。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18（1.7 ?m，100 mm×2.1 mm）;柱溫：30 ℃;進樣量：10 ?L;流速：0.2 mL/min;流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～6 min，10%～30% A;6～9 min，30%～50% A;9～9.5 min，50%～100% A;9.5～12.5 min，100% A;12.5～15 min，100%～10% A。

（2）質譜條件。電離方式：電噴霧電離源，負離子模式掃描，多反應監測（MRM）;用MassLynx 4.1軟件進行數據分析，毛細管電壓為3.0 kV，去溶劑溫度和離子源溫度分別為400 ℃和150 ℃，碰撞氣體（氬氣）和去溶劑氣體（氮氣）流量分別為0.14 L/min和800 L/h。質譜多反應監測（MRM）參數見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件優化

本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液共4種流動相在相同梯度洗脫條件，對氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響。結果表明，4種化合物在不同體系中相應值比較為：甲醇-水<甲醇-0.1%甲酸溶液<乙腈-水=乙腈-0.1%甲酸溶液，故選擇含有乙腈體系的流動相;試驗對4種化合物在不同體系中的峰形進行比較，發現含有甲酸組的對稱性優于不含甲酸組的。因此，本研究選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

用甲醇分別配制氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜化合物的濃度為200 ng/mL，通過質譜注射泵直接進入質譜進行MS掃描，優化毛細管電壓和碰撞能量，選擇響應豐度較高、干擾較少的作為定量離子對。質譜參數見表1;氟蟲腈藥物的MRM色譜圖見圖1。

2.2 提取溶劑的優化

選擇雞蛋為試驗樣品，考察了甲醇/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）（含0.1%甲酸）、乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）和乙腈/水（9∶1）（含1%甲酸）5種提取溶劑對氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜化合物的提取效果。結果表明，含有乙腈組分的提取劑對組織滲透力強，對目標物提取效果好，且沉淀蛋白質及脂肪能力強，因此本試驗選取乙腈作為提取溶劑。隨著甲酸含量的加入，有利于目標物提取，當加入量超過0.5%時，提取效率明顯降低。因此，選擇乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）為本試驗的提取溶劑，提取回收率在78%～107.4%。

2.3 鹽析劑的優化

加入無水MgSO4可促使蛋白質變性分散，防止樣品形成塊狀影響提取回收，同時能吸取提取溶劑中的水分，促進目標化合物溶解在乙腈層;加入氯化鈉有利于水相和有機相分離，降低目標物在水層中的溶解度，更加有利于藥物的提取。本文考察了9組鹽析劑無水硫酸鎂和氯化鈉的組合，分別為2 g和3 g、2 g和2 g、2 g和1 g、1 g和3 g、1 g和2 g、1 g和1 g、0.5 g和3 g、0.5 g和2 g及0.5 g和1 g。在雞蛋空白樣品濃度為0.02 mg/kg添加水平下，隨著無水硫酸鎂含量增加，氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜回收率逐漸變大，當無水硫酸鎂含量為1.0 g時，4種目標物的回收率為78%～107.4%，再次增加無水硫酸鎂質量時，4種目標物的回收率出現明顯下降;而在試驗中選取的氯化鈉的添加質量在1 g時，4種目標化合物的回收率最高。可能由于無水硫酸鎂和氯化鈉含量增加，造成失水嚴重而目標物被包裹在鹽析劑空隙中。因此，選擇1 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉為鹽析劑。

2.4 凈化劑含量的優化

C18作為凈化劑，可以去除雞蛋樣品中脂肪、維生素和甾醇等非極性物質，降低雜質的影響，減小基質效應，保證試驗結果的準確性。試驗考察了加入量分別為5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的凈化劑C18對氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈和氟蟲腈砜的影響。研究證明C18為10 mg時，添加濃度為0.02 mg/kg，獸藥的回收率范圍在78%～107.4%。

2.5 基質效應、檢出限和定量限

按如下公式計算評價基質對各化合物的基質效應：

ME（%）=（B-A）/A×100

式中：ME為基質效應;A為初始流動相溶液標準曲線的斜率;B為基質配制標準曲線的斜率。若20%>ME>-20%，則為基質效應可以接受，否則存在較強的基質抑制或增強效應[9]。根據表2可知，4種藥物在雞蛋中的基質效應均在可接受范圍內（20%>ME>-20%），為了定量準確，選擇基質加標標準曲線法定量。

由表2可知，氟蟲腈及其代謝物在10～100 ng/mL范圍內線性關系較好，相關系數r≥0.995。以S/N=3和S/N=10計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），4種目標化合物的LOD和LOQ分別為0.162～0.685 ?g/kg和0.541～2.285 ?g/kg，滿足雞蛋中多種獸藥殘留的測定需求。

2.6 準確度和精密度

在雞蛋空白樣品添加濃度為0.02 mg/kg水平下，進行8次平行試驗。采用基質匹配標準曲線進行定量分析，由表3可知，4種化合物的平均加標回收率在78.0%～107.4%，相對標準偏差在3.93%～5.66%，方法具有較好的準確度和重現性。

2.7 實際樣品測定

樣品《食品安全國家標準 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》（GB 23200.115—2018）和本方法同時檢測1個陰性樣品和2個陽性樣品，獲得的結果是一致的，同時做加標質量控制樣品，4種藥物的回收率在75%～112%范圍內。樣品中檢測出氟甲腈，其余藥物均未檢出。根據結果顯示，兩種方法檢測的結果差異小。

3 結論與討論

本文建立了基質固相分散-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞蛋中的氟蟲腈及其代謝物殘留方法。本方法快速、簡便、靈敏度高、準確，可用于檢測雞蛋中的氟蟲腈及其代謝物殘留同時測定。與現行國家標準及農業部公告相比，該方法能實現不同性質的多類獸藥殘留同時檢測，大大縮短了檢測周期，節約了檢測成本，為相關的檢測機構提供了理論依據和技術支持。

參考文獻

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[2]黎小鵬，梁雪琪，陳楠，等.超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀檢測動物源性食品中氟蟲腈及其代謝物[J].安徽農業科學，2019，47（14）：204-206.

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[8]馮程程，劉新剛，董豐收，等.5種動物源食品中的氟蟲腈及其3個代謝物殘留量檢測[J].植物保護，2019（5）：207-213.

[9]國家衛生健康委員會，農業農村部，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準-雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定-液相色譜-質譜聯用法：GB 23200.115—2018[S].北京：中國標準出版社，2018.