QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中的氯霉素類獸藥殘留

何江

摘 要：目的：建立了QuEChERS方法結合高效液相色譜-串聯質譜測定雞蛋中氯霉素類獸藥殘留分析方法。方法：雞蛋樣品以80%乙腈水提取，加入鹽析劑處理，取上清液經C18凈化，UPLC-MS/MS測定。結果：目標化合物在0.010～0.100 ?g/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數R≥0.991，檢出限和定量限分別為0.505～0.750 ?g/kg和1.683～2.500 ?g/kg。在0.01 mg/kg添加水平下，氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加標回收率范圍在76.5%～108.0%，相對標準偏差（RSD）范圍在5.33%～6.01%。結論：本方法快速、簡便、準確，可用于雞蛋中氯霉素類藥物的殘留測定。

關鍵詞：QuEChERS;超高效液相色譜-串聯質譜;雞蛋;氯霉素

雞蛋營養豐富，富含優質蛋白質、維生素和礦物質等，是餐桌上常見的食品。氯霉素類抗生素具有廣譜性，能有效治療動物疾病。但是，氯霉素存在嚴重的毒副作用，如能抑制人體骨髓造血功能，引起人體的再生障礙性貧血，粒狀白細胞缺乏癥[1]。由于氯霉素類藥物價格低廉，療效好，在畜禽養殖過程中會殘留在雞蛋中，對人們的健康和環境構成嚴重危害，我國已經明確規定氯霉素不得在雞蛋中檢出[2]。

QuEChERS前處理方法具有快速、簡便、廉價、有效、耐用、安全等特點，是近年來應用廣泛的樣品前處理技術，常常用于獸藥殘留分析。氯霉素類藥物的測定方法主要有氣相色譜法[3]、氣相色譜-質譜法[4]、液相色譜-串聯質譜法[5]等，其中超高效串聯質譜法具有分析速度快和靈敏度高的特點。本研究在QuECHERS方法的基礎上，對提取溶液種類和凈化劑含量等參數進行了優化，結合UPLC-MS/MS測定，建立了一種快速、有效、簡便的測定雞蛋中氯霉素類藥物的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：MixOne數顯渦旋振蕩器（合肥艾本森科學儀器有限公司）;高速離心機（日本Hitachi Limited公司）;FSH-2可調高速電動勻漿機（上海天由儀器科技有限公司）;Milli-Q超純水凈儀（美國Millipore公司）;超聲波清洗器（浙江納德科學儀器有限公司）;Waters XEVO MS超高效液相串聯質譜儀（美國Waters公司）。

試劑：氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺標準品溶液（100 ?g/mL）（北京壇墨質檢科技有限公司）;乙腈、甲酸和甲醇（HPLC級，美國德國MERCK公司）;實驗室用水為Milli-Q超純水;十八烷基鍵合硅膠填料（C18）和石墨化炭黑（GCB）（美國Agilent公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別吸取濃度為100 ?g/mL標準溶液（氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺），用甲醇配制成濃度為2.0 ?g/mL的混合標準儲備液。準確吸取適量混合標準儲備液，用空白提取液稀釋成濃度為0.01 ?g/mL、0.02 ?g/mL、0.04 ?g/mL、0.08 ?g/mL和0.10 ?g/mL的基質混合標準溶液，流動相（甲醇∶水=10%∶90%）稀釋成濃度梯度為同系列濃度的溶劑混合標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

稱取雞蛋樣品2.00 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈-水（8∶2，V/V）（含0.1%甲酸）提取，高速勻漿，靜置5 min，加入1 g MgSO4和1 g NaCl，劇烈振蕩3 min后，超聲提取10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液于5 mL離心管中，加入10.0 mg固相萃取填料C18進行凈化，10 000 r/min離心10 min，過0.22 ?m濾膜后，UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）;流動相：A為0.1%（V/V）甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～3 min，20% B;3～5 min，80% B;5～8 min，100% B;8～10 min，10% B。流速：0.2mL/min;進樣量：5 ?L。

1.2.4 質譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）;負離子模式掃描（氟苯尼考胺為正離子模式）;多反應監測（MRM）;電噴霧電壓：3.5 kV，離子源和離子化溶劑溫度分別為150 ℃和500 ℃，離子化和錐孔氣體流量分別為1 000 L/h和50 L/h。質譜參數見表1。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

本研究考察了6種提取溶劑的提取效果，分別為90%甲醇水、80%甲醇水、70%甲醇水、90%乙腈水、80%乙腈水和70%乙腈水。結果表明，含有甲醇組的提取液色素干擾嚴重，蛋白沉淀效果差，影響目標物提取，回收率均在60%以下。乙腈組織滲透力和沉淀蛋白質能力強，本試驗選取乙腈作為提取溶劑。提取劑中加入水的含量對目標物氟苯尼考胺的提取有顯著影響，其中提取劑中含水量為10%和20%時，氟苯尼考胺回收率無差異，當提取劑中含水量下降到30%時，氟苯尼考胺的回收率從90%下降為50%。為了減少有機溶劑乙腈的用量，節約成本，因此，選擇乙腈-水（8∶2，V/V）為提取溶劑，提取回收率在76.5%～108%，按照GB/T 27404—2008準確度要求，該方法滿足農藥殘留檢測的要求。

2.2 凈化劑的選擇

C18可以去除提取液中非極性物質，降低干擾和減小基質效應，提高分析結果的準確性和重現性;GCB可以消除色素對試驗結果的干擾和質譜離子化的影響。本文分別考察了加入5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的C18加入量對目標物的影響。研究證明C18為20 mg，添加濃度為0.01 mg/kg時，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率范圍在76.5%～108%。同時，當在20 mg C18中加入20 mg GCB時，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收范圍為75.6%～92.4%，為了節約成本和減少試驗步驟，本研究選擇不加GCB。因此，本研究選擇凈化劑為C18，添加量為20 mg。

2.3 色譜-質譜條件選擇及優化

在相同梯度洗脫條件下，考察了流動相甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液對氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素的分離度、靈敏度和峰型的影響。試驗表明，以乙腈水體系為流動相時，氟苯尼考胺保留時間小于0.5 min;以甲醇水體系作為流動相時，氟苯尼考胺能有效保留，保留時間為1.27 min，本研究選擇洗脫能力弱的甲醇體系，圖1為氯霉素類藥物在甲醇體系的MRM色譜圖。

氯霉素類藥物用甲醇配制成濃度為200 ?g/L，質譜注射泵直接進入質譜進行MS掃描，優化毛細管電壓尋找母離子;優化碰撞能量，選擇響應高和干擾小的子離子作為定量離子。電離模式、定量離子對、定性離子對、碰撞能量及錐孔電壓見表1。

2.4 基質效應、檢出限和定量限

配制基質匹配混合標準溶液，UPLC-MS/MS進行檢測。在0.010～0.100 ?g/mL范圍內溶劑和基質匹配標準曲線的線性相關系數R≥0.991。以定量離子的信噪比S/N=3和S/N=10分別計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[6]，氯霉素類化合物在雞蛋基質中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.505～0.750 ?g/kg和1.683～2.500 ?g/kg，結果見表2。

在UPLC-MS/MS檢測復雜樣品時，易受樣品基質的干擾，影響目標物的離子化，產生增強或抑制效應，稱為基質效應（Matrix Effect，ME）[7]。基質效應=基質匹配校準曲線的斜率/溶劑標準校準曲線的斜率，比值越接近1，則基質效應越小;比值在0.8～1.2范圍內，則表明基質效應不明顯。基質效應見表2，除氟苯尼考胺外，氯霉素和氟甲砜霉素在雞蛋中基質效應較為明顯，因此采用空白基質匹配標準曲線以降低基質效應的影響。

2.5 回收率與精密度

選擇空白雞蛋樣品，在0.01 mg/kg添加水平下，進行6次平行試驗。采用基質匹配標準曲線進行定量分析，氯霉素類藥物在雞蛋基質中的回收率與相對標準偏差結果見表3。氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加標回收率范圍在76.5%～108.0%，相對標準偏差（RSD）范圍在5.33%～6.01%，符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[8]。

2.6 實際樣品測定

隨機選取超市和養殖場的動物源性食品，包括超市雞蛋12份和養殖場21份，共33份樣品，運用所建立的方法對樣品進行檢測，同時做方法對比，運用國標方法《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）[9]。結果顯示，所測的33份雞蛋樣品均未檢出氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素。

3 結論

本文利用QuEChERS方法結合超高效液相色譜-三重四極桿質譜法，建立了雞蛋樣品基質中氯霉素獸藥殘留的測定方法。該方法快速、簡便、靈敏，能夠對樣品中的目標化合物進行準確的定性和定量分析，采用基質匹配校正曲線定量，能最大程度地消除基質干擾，使檢測結果更加精確，適用于動物源性食品雞蛋中獸藥殘留的快速檢測。

參考文獻

[1]武書庚.雞蛋的營養價值和對人體健康的益處[J].養生大世界，2020（9）：80-81.

[2]崔榮飛，趙興鑫，田梅，等.動物源性食品中非法添加物殘留危害及檢測技術[J].今日畜牧獸醫，2019，35（12）：1-3.

[3]郭軍，王文蘭，趙全東，等.氣相色譜法測定水產品中氯霉素殘留的不確定度評定[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（23）：6216-6220.

[4]張春輝.氣相色譜質譜法同時測定動物組織中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺及氯霉素[J].企業科技與發展，2020（9）：79-81.

[5]黃建芳.QuEChERS/高效液相色譜-串聯質譜法同時測定大黃魚中五氯酚及氯霉素類藥物殘留[J].現代食品，2020（21）：170-173.

[6]郭學桃.化學檢測中檢出限的測定與運用[J].大眾標準化，2018（5）：42-45.

[7]周劍，王敏，楊夢瑞.液相色譜質譜分析中的基質效應研究[J].農產品質量與安全，2018（1）：67-70.

[8]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.實驗室質量控制規范 食品理化檢測GB/T 27404—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[9]國家質量監督檢驗檢疫總局.動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定GB/T 22338—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.