牛黃類藥材及其偽品中27 種元素含量分析

欒 潔，丁 晴

1 江南大學 藥學院，無錫 214000；2 無錫市藥品安全檢驗檢測中心，無錫214028

牛黃（Bovis Calculus）為我國傳統名貴中藥，藥用歷史悠久，是牛科動物牛（Bos taurus domesticus Gmelin）干燥的膽結石[1]，習稱“天然牛黃”。其性甘、味涼，歸心、肝經。具有清心、豁痰、開竅、涼肝、息風、解毒的功效，多用于熱病神昏，中風痰迷、驚癇抽搐、癲癇發狂、咽喉腫痛、口舌生瘡、癰腫疔瘡[2]等癥候。天然牛黃資源匱乏，價格昂貴，常需進口，國家先后批準了體外培育牛黃、人工牛黃，作為天然牛黃的代用品[3]。體外培育牛黃是以牛的新鮮膽汁，加入去氧膽酸、膽酸、復合膽紅素鈣等制成[2]，其與天然牛黃在成分、質量、藥理作用等方面都較為相似。人工牛黃是由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成[1]。

電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優點，是目前元素測定較常用的方法。在中藥材產地溯源、中藥材及制劑質量評價、中藥炮制加工等方面均有較多應用[4，5]。

牛黃含諸多種元素，在牛黃多種藥理作用的發揮中起著至關重要的作用。本實驗選取牛黃類藥材（天然牛黃、人工牛黃、體外培育牛黃）及其偽品為研究對象，采用ICP-MS 法對27 種元素的含量進行測定，并對結果進行分析討論，以期為3 類不同來源牛黃的快速鑒別提供依據。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Thermo iCAP Qc 電感耦合等離子體質譜儀（美國熱電公司）；MARS 6 微波消解儀（美國CEM公司）；XSE 205DR 電子天平（梅特勒公司）。

1.2 藥品與試劑

26 種元素（鈉Na、鎂Mg、鋁Al、鉀K、鈣Ca、鉛Pb、鎘Cd、砷As、銅Cu、鈹Be、鈦Ti、釩V、鉻Cr、錳Mn、鐵Fe、鈷Co、鎳Ni、鋅Zn、錫Sn、硒Se、鍶Sr、鉬Mo、銀Ag、銻Sb、鋇Ba、鉈Tl）混合標準溶液（濃度為100 μg·mL-1，美國SPEX CertiPrep.公司）；內標（鉍Bi、鍺Ge、銦In、鋰Li6、鈧Sc、鋱Tb、釔Y）混合溶液（濃度：10 μg·mL-1，美國SPEX CertiPrep.公司）；汞單元素標準溶液（濃度為1000 μg·mL-1，中國計量科學研究院）；金單元素標準溶液（濃度：1000 μg·mL-1，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）。

ICP-MS iCAP Q/RQ Tune Solution 含Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U，濃度為（1.00±0.05）μg·L-1（賽默飛世爾科技公司）；硝酸為優級純；水為超純水。

1.3 樣品

3 類牛黃樣品均從市場收集，經無錫藥品安全檢驗檢測中心中藥室鑒定確認。樣品信息見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 儀器工作條件與測量條件

ICP-MS 工作條件：等離子體射頻功率：1545 W，霧化氣流量為1.04 L·min-1，冷卻氣流量為13.99 L·min-1，輔助氣流量：0.788 L·min-1，碰撞氣：He，碰撞氣流量：3.92 L·min-1，測定模式：動能歧視（KED）模式。

測量方式及條件：采用標準曲線法，積分時間10s，延遲時間1s，重復3 次。根據測定元素的質量數，選取合適同位素，9Be、23Na、24Mg 以6Li 為內標；27Al、39K、

43Ca、47Ti、51V、52Cr、55Mn、56Fe 以45Sc 為內標；59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、82Se 以72Ge 為內標；88Sr、95Mo、107Ag 以89Y 為內標，114Cd、118Sn、121Sb 以115In 為內標；138Ba 以159Tb 為內標；202Hg、205Tl、208Pb 以209Bi 為內標。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準混合溶液精密量取26 種元素混合標準溶液（Na、Mg、Al、K、Ca、Pb、Cd、As、Cu、Be、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Sn、Se、Sr、Mo、Ag、Sb、Ba、Tl，濃度均為100 μg·mL-1）適量，用10%硝酸稀釋制成濃度為0、10、50、100、250、500 ng·mL-1的系列濃度混合溶液。精密量取汞元素標準溶液（濃度1000 μg·mL-1）適量，用10%硝酸溶液稀釋制成濃度為0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng·mL-1的溶液（臨用新配）。

2.2.2 內標溶液精密量取內標混合溶液適量，用水稀釋制成濃度為1 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液取各樣品粉末（過四號篩）約0.2 g，精密稱定，置50 mL 聚四氟乙烯消解罐中，加硝酸5 mL，于加熱板上120 ℃預消解30 min，放冷，將消解罐置于微波消解儀中，按表2 的程序進行消解，冷卻，將樣品轉移至50 mL 聚四氟乙烯量瓶中，用少量水洗滌3 次，加入金單元素標準溶液（1 μg·mL-1）200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，離心分取上清液，即得。

表2 微波消解程序

2.2.4 空白溶液備除不加金單元素標準溶液外，其余同“2.2.3”供試品溶液制備步驟。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察取標準混合溶液，按“2.1”測量條件進樣測定，以進樣濃度為橫坐標，測量值（3次讀數的平均值）為縱坐標，繪制標準曲線，得到Be、Na、Mg 等27 種元素的線性與范圍。結果表明，各元素的標準曲線性關系良好，相關系數在0.992 9～0.999 7。線性回歸方程見表3。

表3 線性關系考察、進樣精密度、檢出限及進樣精密度

2.3.2 儀器精密度試驗取26 種元素標準混合溶液（濃度為50ng·mL-1）和汞元素標準溶液（1ng·mL-1），按“2.1”測量條件連續進樣6 次，計算各元素濃度的RSD 在0.5%～2.4%（n=6），結果見表3，表明儀器進樣精密度良好。

海洋鉆井公司規定，含油巖屑回收由平臺提出申請，公司負責安排相應的船舶轉運，并聯系陸地有資質的單位來處理。每一個環節，都要求相關人員對巖屑運送情況做好如實記錄，做好全過程的控制。

2.3.3 檢出限設定取空白樣品溶液，連續測定11次，計算各元素響應值的標準偏差（SD）,以3 倍SD值作為檢出限（LOD），結果見表3。

2.3.4 重復性試驗取牛黃樣品（NH-1）粉末約0.2 g，共6 份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法進行消解，制備供試品溶液，測定，結果見表3。

2.3.5 加樣回收率試驗取牛黃樣品（NH-4）粉末約0.1 g，共12 份。6 份加入26 種元素混合標準溶液（濃度：100 μg·mL-1）1 mL 和硝酸4 mL，作為Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn 9 種元素的加標回收樣品；6 份加入26 種元素和汞元素混合溶液（濃度：0.5 μg·mL-1）1 mL 和硝酸4 mL，作為剩余18 種元素的加標回收樣品，按“2.2.3”項下方法消解制備，以回收率溶液中待測元素響應值和內標元素響應值的比值，扣除試劑空白后，以線性回歸方程算得各待測元素的含量，并計算加樣回收率，結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.4 測定結果

分別取各樣品溶液，按“2.1”測量條件進樣測定，每個樣品測定3 次，取平均值，以線性回歸方程計算相應元素的濃度，并計算樣品含量。結果見表5。

表5 各種牛黃樣品測定結果（mg·kg-1）

3 分析與討論

3.1 3 類牛黃的元素種類

在27 種元素中，天然牛黃正品不含Be、Al、Ti、Cr、Ag、Sn 6 種元素；體外培育牛黃正品不含Mo、Ag、Tl、Pb4 種元素；人工牛黃不含Be、Mo、Ag、Sb、Tl、Pb 6 種元素。天然牛黃偽品（NH-2、5）所含元素種類與正品相似，偽品（NH-9、15）含所有的27 種元素；體外培育牛黃偽品（NH-8）只含有Na、Mg、Fe、Ca 等12 種元素，遠少于正品。

3.2 測定結果的主成分分析

采用matlab 9.4 軟件對測定結果進行主成分分析，見圖1。從圖1 看出，天然牛黃正品（NH-1、3、4、6、7）和人工牛黃（NH-12、13、14）大致聚集在一類；天然牛黃偽品（NH-2、5）與體外培育牛黃偽品（NH-8）在一類；體外培育牛黃正品（NH-10、11）在一類；天然牛黃偽品（NH-9）也獨自成為一類。繼續深入分析，通過載荷矩陣，得出第一主成分的值同Ca、Mg 正相關；第二主成分的值同Fe、Cu、Pb 正相關；第三主成分的值同Hg 正相關。

圖1 牛黃主成分分析得分圖

3.2.1 第一主成分鈣、鎂天然牛黃正品的鈣元素含量在1100～1800mg·kg-1，鎂元素含量在180～360mg·kg-1，鈣/鎂比值為4.8～6.8；偽品（NH-2、5）鈣元素含量≥2800 mg·kg-1，鎂元素含量≥370 mg·kg-1，鈣/鎂比值約為7.5，偽品（NH-9、15）鈣元素含量≤250 mg·kg-1，鈣/鎂比值＜0.7。體外培育牛黃正品的鈣元素含量在6600～7590 mg·kg-1，鎂元素含量在730～980 mg·kg-1，鈣/鎂比值為7.7～9.1；偽品（NH-8）鈣元素含量為193 mg·kg-1，顯著低于正品中鈣元素含量。人工牛黃鈣元素含量在1900 mg·kg-1左右，鎂元素含量在130～145 mg·kg-1，鈣/鎂比值為13.5～14.9。

研究天然牛黃形成機理，牛黃是牛的膽結石，是一種病理產物，其形成是一個復雜的病理生理過程。結石形成的重要因素是正常膽汁變為成黃性膽汁，膽汁中的游離膽紅素含量升高，與膽汁中鈣、鎂等金屬離子結合，生成膽紅素鈣鹽沉淀，沉淀在膽汁中的粘蛋白的作用下，形成粒狀物或塊狀物，這是牛黃的小顆粒[6]。所以天然牛黃中含有適量的鈣、鎂元素。文獻資料顯示[7]，體外培育牛黃，是在反應釜中模擬牛膽內的生物環境，取新鮮牛膽汁，加入去氧膽酸、復合膽紅素鈣等通過一系列生物制藥工藝流程制成，故體外培育牛黃中鈣、鎂的含量非常高。

3.2.2 第二主成分鐵、銅、鉛天然牛黃正品中鐵、銅元素含量差異較大，但鐵/銅比值相對固定，在0.14～0.28；偽品的比值均＞0.3，在0.33～19.04。體外培育牛黃正品中銅元素含量在3.5～4.1 mg·kg-1，鐵/銅比值在42～55，偽品中不含銅。人工牛黃銅元素含量為1.7～2.1 mg·kg-1，鐵/銅比值在70 左右。鉛的含量在天然牛黃中最高，其余兩種牛黃中幾乎不含。

3.2.3 第三主成分汞天然牛黃正品中汞元素含量均＜1.0 mg·kg-1，其余兩種牛黃中含量均＞1.0 mg·kg-1。

3.3 其他元素的含量

體外培育牛黃中鋁、鉻、鈦的含量最高，天然牛黃中幾乎不含；天然牛黃中錳的含量較高，體外培育牛黃、人工牛黃中幾乎不含或含量很少；體外培育牛黃中鍶的含量最高，其次為人工牛黃。

4 小 結

本實驗結果表明，天然牛黃、體外培育牛黃、人工牛黃在元素種類上差別不大。通過主成分分析，27 種元素中以鈣、鎂、鐵、銅、鉛的含量差異最為顯著，其中鈣/鎂比值、鐵/銅比值可作為鑒別天然牛黃、體外培育牛黃、人工牛黃及其相應偽品的重要參數。采用本實驗的元素主成分分析法可以快速的分類3 種牛黃及其相應的偽品，為牛黃類藥材及其偽品的元素鑒別提供了數據支持。