有限取樣法估算中國腎移植患者單個核細胞內他克莫司的暴露量*

王曦晗，邵 琨，安會敏，周佩軍，陳 冰**

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 1藥劑科；2 移植中心，上海200025

他克莫司（tacrolimus，TAC）是一種常用的免疫抑制藥物，目前已逐步替代環孢素成為主要使用的鈣調磷酸酶抑制劑。它在臨床上常與霉酚酸和皮質類激素合用、廣泛用于腎移植術后的免疫抑制治療。TAC 的生物利用度個體間差異較大，受肝臟和小腸首過效應及紅細胞比例和血紅蛋白濃度的影響，TAC 的生物利用度可以從5%到90%，并且有著狹窄的治療窗口[1]。為了減少TAC 的腎毒性，提高其有效性，在常規進行治療藥物濃度監測的基礎上進行個體化給藥是合理的手段。臨床上多對TAC 全血谷濃度進行監測，但谷濃度合適范圍內的患者仍然存在毒性或排斥反應，這說明全血谷濃度與藥效學指標或毒性發生之間的相關性存在爭議[2]。

近年研究發現約90%以上TAC 在進入體循環后與紅細胞結合；但只有少量藥物能進入淋巴細胞而發揮免疫抑制作用，外周血單個核細胞（PBMC）內TAC的變化可能是更好的監測指示[3]。Capron A 等[4]研究了96 例腎移植患者的細胞內TAC 濃度，發現急性排斥反應的發生率與低水平的細胞內TAC 濃度之間存在關聯性。在另一項針對肝移植患者的研究中，移植后一周出現臨床排斥反應的患者TAC 的PBMC濃度明顯低于未出現排斥反應的患者[5]。TAC 在體內的暴露量能更好地反映藥效與毒性。藥時曲線下面積（AUC）被認為是目前反映藥物暴露量的一個最佳標志[6]。精準計算AUC 需要在服藥期間采集大量的標本（8～12 個采血點），但是這在臨床實踐中較為困難。有限取樣法（limited sampling strategy，LSS）的策略，通過采集少量標本（2～4 個采血點）可對AUC0～12h進行較準確地估算[7]。基于以上觀點，本研究擬通過利用多元線性回歸法，建立一個LSS 模型，用于估算中國腎移植患者PBMC 內TAC 的AUC0～12h，以達到優化個體化給藥的目的。

1 材料和方法

1.1 對象與方案

選擇2017～2018 年在本院器官移植中心進行腎移植的患者，術后均采用TAC+霉酚酸+皮質類激素的三聯免疫抑制方案：術后口服TAC（商品名：樂可復，安斯泰來制藥）0.1 mg·kg-1·d-1，每日2 次，調整劑量使谷濃度維持在10～13 ng·mL-1；術前6 h 內口服霉酚酸酯（商品名：驍悉，瑞士諾華制藥）1000 mg，術后每日1000 mg、給藥2 次，并根據患者霉酚酸暴露量調整劑量；術中使用甲潑尼龍500 mg iv gtt，術后第1～7 天將甲潑尼龍280 mg 逐漸遞減至40 mg iv gtt，以后改用口服潑尼松20 mg·d-1。術后達穩態采集患者服用TAC 后全血分離PBMC。

試驗方案獲本院附屬瑞金醫院倫理委員會批準，并簽署患者知情同意書。

1.2 材料和儀器

他克莫司對照品（批號：20111101，純度：98%）和內標子囊霉素標準品（批號：20111117，純度：98.5%）均購于大連美侖生物技術有限公司；人外周血淋巴細胞分離液（批號：10291481）購于通用電氣醫療集團（GE 醫療生命科學部）；20×PBS 緩沖液（批號：FC16KA4123）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜級）購自Tedia（費爾菲爾德，美國）；甲酸銨為分析純。

API 4000 型三重四級桿質譜儀（美國Applied Biosystems 公司），配備電噴霧離子化源（ESI）；UFLC色譜系統（日本島津公司）；BS224S 型萬分之一精密天平（德國Sartorius 公司）；Eppendorf 5804R 臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.3 患者PBMC 樣本采集

腎移植術后2 周，患者達到穩態。在服藥前和服藥后0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 經肘靜脈采血3～5 mL 置于EDTA 抗凝管中，采用梯度密度離心法，收集各個時間點患者PBMC，細胞計數后置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 樣本測定

患者PBMC 內TAC 的濃度采用前期建立的LC-MS/MS 法進行檢測。色譜條件：采用Zorbax C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm）[8]；流動相：由A 相（2 mmol·L-1甲酸銨水溶液）與B 相（2 mmol·L-1甲酸銨甲醇溶液）組成，A 相與B 相比例如下：20%B（0～0.5 min），20%～100%B（0.5～1.5 min），100%B（1.5～5min），100%～20%B（5～6min）和20%B（6～7min）；柱溫：40 ℃；流速：0.35 mL·min-1。

質譜條件：采用電噴霧離子化電離源（ESI），正離子方式檢測；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度500 ℃；GS1 壓力：275.79 kPa；GS2 壓力：275.79 kPa；掃描方式為多重反應監測（MRM）；TAC 和子囊霉素的離子對分別為m/z 821.7 →m/z 768.5 和m/z 809.6→m/z 756.5；解簇電壓（DP）分別為：101.7 eV 及97.7eV；碰撞能量（CE）分別為：10.6 eV 及10.5 eV。碰撞室射出電壓（CXP）分別為：10.7 V 和10.4 V。

該方法經過體內藥物分析方法學指標的驗證，結果均滿足生物樣本的檢測要求。

1.5 藥動學參數計算

采用WinNonlin 軟件以非房室法計算TAC 藥動學參數。依據線性梯形法則計算用藥后0～12 h 患者PBMC 中TAC 的AUC，Cmax、Tmax和AUC0～12h均為實際測量值。

1.6 LSS 模型的建立和驗證

依據線性梯形法則計算用藥后0～12 h 患者PBMC 中TAC 的藥-時曲線下面積AUC0～12h的實測值。采用SPSS 25.0 和SAS 9.13 軟件對數據進行統計分析，結果表示為平均值±標準差（）；P<0.05為差異具有統計學意義。

采用逐步多元線性回歸分析（MRA）方法估算TAC PBMC 內AUC0～12h的模型方程，以決定系數r2最大為最優準則。以1～4 個點的TAC 的PBMC 內濃度作為自變量，以AUC0～12h為因變量，按照下面公式估算TAC 的AUC0～12h確定TAC AUC0～12h簡化計算模型方程：

其中，b 為截距，Mi為偏相關系數，Cti為采樣時間點為ti時PBMC 內的TAC 濃度。

預測誤差（prediction error，PE）和絕對預測誤差（absolute prediction error，APE）計算公式如下（式1 和式2），其中AUC（0～12）Obs和AUC（0～12）Est分別表示為AUC0～12h的觀測值和估算值。并計算平均預測誤差（MPE）表示模型的準確度（式3），計算平均絕對預測誤差（MAPE）代表模型的精密度（式4）。MPE與MAPE 值應分別小于10%和15%[9]。另外采用Bland-Altamn 方法評估AUC0～12h觀測值和AUC0～12h估算值之間的一致性，其界限表示為x±1.96 SD。

2 結果

2.1 患者的基本信息

本研究共納入了23 例腎移植術后患者，其中女性為9 人，男性14 人。患者基本特征見表1。23例腎移植患者經多次給藥達穩態后的藥-時曲線見圖1。AUC0～12h（23.18±14.52）ng·h/million PBMC，C0（1.28±0.88）ng/million PBMC，Cmax（3.73±2.31）ng/million PBMC，Tmax（4.79±3.08）h。TAC PBMC 和全血中谷濃度的相關性較弱（r2=0.1567，P=0.056）。

圖1 中國腎移植患者TAC PBMC 內的藥物濃度-時間曲線

表1 24 例腎移植患者的基本情況和實驗室檢查

2.2 有限取樣模型的建立

以梯形法計算患者實測TAC 的AUC0～12h，利用多元線性回歸擬合1～4 個采血點TAC 之AUC0～12h估算模型，篩選出決定系數r2較大的不同采血點的模型1～17，結果見表2。然而發現C0與AUC0～12h之間的相關性并不好（r2=0.570），模型引入峰濃度的影響（C0h-C6h）后相關性有所改善（r2=0.820）；但并未達到預測標準（MPE=2.48±19.71，MAPE=17.03±9.37）。相比于單點法或二點法，三點法或四點法相關性更好，且誤差較小。結合臨床因素和r2最大、最優原則，最終選擇相對最優模型作后續評價。

表2 多元線性回歸法估算細胞內TAC AUC0～12h 的LSS預測模型

2.3 模型的方案評價

采用Bland-Altman 分析方法評價4 組模型AUC0～12h觀測值和AUC0～12h模型預測值之間的一致性（見圖2）。從圖2 中可看見模型4、9、14、17 的觀測值與預測值的差值多數在觀測值的2 個SD 以內，說明模型的預測誤差較小。進一步通過bootstrap分析對所得到的LSS 模型進行驗證，該分析是從原始數據集中生成1000 個復制數據集，用于評價不同模型的穩定性及參數估算的準確性（見表3）。從這些數據上看，平均值和95%CI 與原始數據集的估算參數具有可比性。結果表明，所選擇的模型在準確性和穩定性方面都是可以接受的。

圖2 Bland-Altman 分析法評價模型4、9、14、17 估算的

TAC AUC0～12h觀測值和AUC0～12h估算值間的一致性

3 討論

對于接受TAC 治療的患者而言，維持一個合適的藥物水平以避免移植后排斥反應的發生和藥物相關的毒性作用是至關重要的。雖然有些研究已成功建立了TAC 全血AUC0～12h有限取樣模型[10、11]。循環內大部分的TAC 都與紅細胞結合，由于受到患者個體間紅細胞壓積的差異（31%～49%）及紅細胞藥物結合能力差異等因素的影響[12]，全血中TAC 不同患者之間差異較大[13]。TAC 通過抑制淋巴細胞內CaN活性，進而影響T 細胞活性，達到免疫抑制的效果。因此與全血濃度相比，淋巴細胞內藥物濃度可能與藥物療效聯系更為緊密。T 淋巴細胞是PBMC 的重要組成部分，其中CD4+T 細胞占PBMC 的60.2%[14]。評估淋巴細胞內TAC 需要一個復雜的提取過程，而PBMC 可以作為監測的首選基質；但基于TAC 的PBMC 內的有限取樣模型尚未見報道。有共識表明，對于TAC 全血AUC0～12h而言，維持150～200 ng·mL-1·h-1[15]。但目前TAC PBMC 的藥動學結果之間研究有限，AUC0-12h范圍與臨床之間的關系還不完全清楚。監測全血谷濃度是臨床上估算全血中TAC 暴露量的常規做法；但是發現在PBMC 中，C0與AUC0-12h之間僅存在中等相關（r2=0.570），且預測值存在較大的偏差，表明C0只是AUC0～12h的部分反映。隨著更多取樣點的加入，模型的預測的精密度和準確性更好，因為包含更多的取樣點的模型提供了更大的相關性。對此也分析了包括1～4 個不同時間采樣點的LSS 模型，結果表明，1、2、3、4 個采樣點分別以C6h（r2=0.787 0）、C0.5h-C6h（r2=0.849 0）、C2h-C4h-C6h（r2=0.974 0）、C2h-C4h-C6h-C10h（r2=0.989 0）為最佳模型。TAC 峰濃度附近采樣點例如C4h和C6h對模型的預測至關重要。模型方程14（C2h-C4h-C6h）和17（C2h-C4h-C6h-C10h）優于其他，選取其他采樣時間點的包含3或4 時間點的模型方程。模型方程14 和17 的MPE和MAPE 分別為-0.00±10.24%與0.00±8.24%，7.82±6.38%與6.08±5.40%。需要注意的是，特別是對于門診隨訪的患者而言，給藥后10 h 采集標本并不方便。因為模型方程14（C2h-C4h-C6h）和17（C2h-C4h-C6h-C10h）具有更為準確的預測性能，可能對依賴于準確估算PBMC 內TAC AUC0～12h來調節劑量的住院患者具有更大的價值。C0.5h-C6h也有較好的精確度和較低的偏差（MAPE<10.57%，76.47%的預測PE 值在±15%范圍內）。這個模型可能更適合需要在較短時間內采集標本的門診隨訪患者。

本研究尚存在著一些缺陷，首先僅有23 例完整藥-時曲線標本，數據并沒有分成模型組和驗證組。其次，LSS 模型建立是基于接受包括TAC 在內的三聯免疫抑制治療，沒考慮無合并類固醇患者的藥代動力學特點。有研究表明，糖皮質激素可能會通過影響細胞色素3A 或p-糖蛋白，而影響TAC 的暴露；但是，糖皮質激素對PBMC 內TAC 藥代動力學的影響還仍然未可知。盡管存在這些局限性，本研究已清楚地表明，與監測TAC 谷濃度相比，有限取樣模型在預測TAC 暴露量方面可能更為準確。

4 結論

綜上所述，本研究成功建立了基于少量取樣點的可靠的多元回歸分析，估計TAC 的PBMC 內AUC0～12h的LSS 模型。內部驗證法證明：該方法在取樣時間方面有更好的靈活性，且具有較好的精密度和準確度，估算方程簡單，適用于臨床上操作和推廣。