新疆部分地區牛環形泰勒蟲優勢種媒介蜱的分子生物學鑒定及種群結構分析

謝小婉，朱馬別克·胡斯曼，加那爾·努和買提，木哈里·吾汗，王志斌

（達坂城區柴窩堡片區管理委員會獸醫站，新疆 烏魯木齊 830052）

牛環形泰勒蟲病是環形泰勒蟲引起的一種蜱傳血液原蟲病。該病在南歐、中亞和中東等地區均有不同程度的流行。我國在西北、東北、華北地區均對該病的流行情況進行過調查[1-2]，結果顯示，吐魯番為該病最為嚴重的疫區之一。雖然每年都會定期針對該病進行疫苗接種，但該病的感染率和發病率仍呈上升趨勢，其中吐魯番市發病率高達40%[3]，嚴重阻礙養牛業的發展。該病的主要傳播媒介是璃眼蜱屬的璃眼蜱[4]。調查顯示，媒介蜱的區系分布、病原攜帶率和遺傳多樣性是蜱傳疾病的主要影響因素。因此，掌握璃眼蜱的區系分布、群落結構和物種組成，對媒介蜱的防控以及蜱傳疾病的防控具有參考意義。本試驗通過體視顯微鏡對8個試驗點所采集的璃眼蜱（N=9 141）進行分子生物學鑒定，分析區系分布特點、種類組成及相對優勢度，明確璃眼蜱種群分布和活動范圍的變化，對該地區媒介璃眼蜱及蜱傳牛環形泰勒蟲病的流行和流行區的變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016～2017年是蜱類活動的高峰期。在吐魯番和阿勒泰地區的8 個試驗點，隨機抽取56 頭牛以及璃眼蜱9 141 枚。按照文獻記載采集牛體表的全部硬蜱[5-6]，記錄采集時間、地點等[7]。

1.2 試劑與儀器

ITS2璃眼蜱引物（由上海生工生物工程有限公司合成）；樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒和快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京賽百盛基因技術有限公司；高純度質粒小提取試劑盒分別購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取

璃眼蜱屬特異性引物[8]序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

50 μL 反應體系：2×EcoTaq PCR SuperMix25 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各1 μL，璃眼蜱DNA 3 μL，雙蒸水加至50 μL。

PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃再延伸10 min。

經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查、PCR擴增得到結果。目的片段純化、克隆，對所獲得的菌液進行PCR驗證，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行同源性分析。

1.3.2 璃眼蜱群落組成參數的計算[9-16]

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

2.1.1 媒介蜱分子生物學鑒定結果（見圖1）

圖1 璃眼蜱ITS2基因序列PCR擴增結果Fig.1 PCR product of Hyalomma ITS2 gene

由圖1 可知，以璃眼蜱屬ITS2基因序列，采用PCR 的方法擴增璃眼蜱DNA，于490 bp擴增出目的條帶。

2.1.2 重組質粒Peasy-T1-ITS-2的序列對比結果

測序結果經BLAST 檢索，顯示本次實驗室獲得目的片區與GenBank 中小亞璃眼蜱、殘緣璃眼蜱、嗜駝璃眼蜱和亞洲璃眼蜱核苷酸相似性在99%～100%之間，為本研究的目的片段。經PCR鑒定：小亞璃眼蜱3 750枚，殘緣璃眼蜱2 468枚，亞洲璃眼蜱914枚，嗜駝璃眼蜱2 009枚。

2.2 新疆部分地區璃眼蜱的群落結構分析

2.2.1 新疆部分地區璃眼蜱相對優勢度、染蜱率和蜱指數（見表2）

表2 采集璃眼蜱相對優勢度、蜱指數和染蜱率Tab.2 Relative dominance,infested indexes and infested ratesof Hyalomma

由表2可知，試驗所抽檢的8個試驗點中的56頭牛，共計采集媒介璃眼蜱9 141 枚。其中，小亞璃眼蜱相對優勢度、染蜱率及蜱指數均為最高分別為41.02%、100%、66.96；亞洲璃眼蜱的相對優勢度最低為10.00%；染蜱率最低的是嗜駝璃眼蜱，為30.00%；亞洲璃眼蜱蜱指數最低，為16.32。

2.2.2 新疆部分地區牛體表寄生璃眼蜱群落結構參數（見表3）

由表3 可知，采集到牛體表的璃眼蜱的物種豐富度為4，多樣性指數為1.282 3，物種均勻度指數為0.925 0，優勢度指數為0.299 4。

表3 寄生璃眼蜱種群、群落組成參數Tab.3 Community structure parameters of parasitic Hyalomma

2.2.3 新疆部分地區璃眼蜱的區系分布（見表4）

由表4 可知，4 種璃眼蜱中，小亞璃眼蜱蜱指數最高，為625.00，占總體的41.02%（625.00/1 523.51），亞洲璃眼蜱蜱指數最小為10.00%（152.34/1 523.51）。由采集地點來看，吐魯番市（包括夏鄉、吐魯番市、伊拉湖鄉、博斯坦鄉4 個地區）蜱總指數為937.67，占蜱總數指數的61.55%（937.67/1 523.51），其中夏鄉的蜱總指數最高，為19.84（302.34/1 523.51）；阿勒泰地區（包括富蘊縣、清河縣、哈巴河縣和福海縣四個地區）蜱總指數為502，占總數的32.95%（502.00/1 523.51），其中青河縣的蜱指數較低，占蜱總指數的 6.12%（93.17/1 523.51）。

表4 不同生境寄生媒介璃眼蜱的蜱指數Tab.4 Infested indexes of parasitic Hyalomma in different regions

2.2.4 新疆部分地區牛體表寄生璃眼蜱群落結構參數（見表5）

由表5可知，伊拉湖鄉種類豐富度為2，較其他7個試驗點低；富蘊縣多樣性指數最高，為1.171 0；伊拉湖鄉物種均勻度指數最高，為0.966 4。清河縣多樣性指數、均勻度指數均最低，分別為0.5649、0.4075；但優勢度指數最高，為0.7089。

表5 不同生境璃眼蜱的群落結構參數數據Tab.5 Community structure parameters of parasitic Hyalomma in different regions,Xinjiang

3 討論

璃眼蜱的鑒定主要依據形態學[17-18]。分子生物學具有操作簡單、準確率高、適用范圍廣等優勢，不僅能鑒定形態較為完整的媒介蜱外，還可以精確鑒定殘缺、飽血和不成熟的媒介蜱[18]，被廣泛運用于媒介蜱的鑒定。ITS2基因因進化速率快且GenBank 數據量豐富，被用于媒介蜱屬內、種間或種內的系統進化關系研究[6,19]。文章通過ITS2基因檢測采集的9 141璃眼蜱，共鑒定出4種璃眼蜱：小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱和嗜駝璃眼蜱，分別為3 750、914、2 468、2 009枚。1959年，肖成恩[20]首次報道新疆地區媒介硬蜱分類情況。1963年和1977年，于心等[5，21]詳細地記載了新疆媒介蜱的種類、形態特征、生物學特性、地理分布、攜帶病原情況以及媒介蜱的防治，均為媒介蜱及蜱傳疫病提供詳細的參考資料。但隨著全球氣候變暖，璃眼蜱的種群分布有所變化[22]。王冰潔[23]從綿羊和山羊體表獲得了寄生于牛、馬、駱駝的殘緣璃眼蜱，在馬體表采集到了僅寄生于駱駝的嗜駝璃眼蜱。朱玉濤[24]在布爾津縣、福海縣首次采集到刻點血蜱和圖蘭扇頭蜱，在富蘊縣首次采集到銀盾革蜱和森林革蜱，在碩縣首次采集到銀盾革蜱和草原革蜱。因此，研究不同生境、不同宿主體表寄生媒介蜱的種群結構、區系分布十分必要。通過分子生物學結合統計學對吐魯番和阿勒泰地區牛體表媒介蜱進行鑒定，并進行群落結構分析。結果顯示，小亞璃眼蜱蜱指數、染蜱率、相對優勢度均最高，其相對優勢度高達41.02%，多樣性指數為1.282 3，物種均勻度指數為0.925 0，優勢度指數為0.299 4。吐魯番市多樣性指數和物種均勻度指數均較高，但是優勢度指數較低，優勢度指數和多樣性指數呈反比的關系。調查發現，吐魯番和阿勒泰地區寄生媒介璃眼蜱無差異，豐富度均為4，分析與牛的調出、調入有直接關系，要做好調出、調入牛檢疫工作，檢測牲畜時也要做好媒介蜱檢測。此外，吐魯番市氣候類型屬于大陸性暖溫帶荒漠氣候，阿勒泰地區屬于的溫帶大陸性寒冷氣候表現均為降水量少，蒸發量大；吐魯番坎兒井及大范圍種植葡萄樹，而阿勒泰擁有遼闊的草原；獨特的氣候條件和復雜的地貌環境和土壤結構，為媒介璃眼蜱的滋生提供可行、適宜的生存條件。

4 結論

本試驗采集試驗點的牛體表寄生的媒介璃眼蜱與以往記載媒介蜱的分布基本相符，通過對媒介蜱體表璃眼蜱群落結構進行分析，為該區的媒介璃眼蜱的分類及其蜱傳疾病防治提供數據參考。