芽孢桿菌不同菌種抑菌性強度試驗比較分析

周淑貞，辜質純，李成應，張瑞雪，張 悻，顧萬軍，黃良宗*

（1.佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，廣東 佛山 528234；2.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231）

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陽性、產芽孢的桿狀細菌。芽孢桿菌種類繁多、數量龐大，是自然界中廣泛存在的非致病性細菌[1-2]。芽孢桿菌作為飼料添加劑可提高飼料利用率，降低飼養成本，預防和減少疾病的發生。某些天然活性物質，如抗菌肽，具有潛在的可能性，特別是來源于芽孢桿菌的抗菌肽，因其廣譜抗菌能力以及較為高效的活性而備受關注[3]。芽孢桿菌海陸共棲，是一類公認的抗菌肽或細菌素產生菌[4-6]。抗菌肽的肽鏈結構通過與酰基連接的脂肪酸形成脂肽，由環形肽和脂肪酸組成的脂肽，具有抗菌譜廣、作用迅速強大、不易產生耐藥性等優點[7]。細菌素是由細菌核糖體合成的抗菌肽，一般作用于目標菌株細胞膜，通過破壞膜結構完整性、造成細胞內容物滲漏進而導致細菌死亡。這種不同于抗生素的作用機制使細菌素成為新型抗菌活性物質的研究熱點[4]。

本文從不同環境和益生素產品中分離鑒定12 種共21 株芽孢桿菌。應用濾紙片方法進行芽孢桿菌抑菌性的比較試驗，篩選抑菌性較強的菌株，為益生素的應用研究和芽孢桿菌抗菌肽研發的候選菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養基

LB培養基瓊脂：葡萄糖10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蛋白胨10 g、瓊脂17 g（固體培養基添加），調節pH 值7.0，121 ℃，20 min滅菌，備用。

1.2 指示菌

大腸桿菌（K12D31）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。

1.3 試驗菌株及來源

試驗分離芽孢桿菌菌種（株）均分離自自然環境和益生菌產品，見表1。

表1 試驗分離鑒定菌種（株）來源Tab.1 Isolate and identify the source of strain

1.4 細菌培養

1.4.1 指示菌培養

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于LB 培養基，37 ℃，120 r/min 培養16～24 h，細菌濃度約為OD600nm=1.0，取出，4 ℃保存，備用。

1.4.2 枯草芽孢桿菌培養

將枯草芽孢桿菌應用普通瓊脂平板分離培養，挑取典型菌落，接種于LB培養基，37 ℃，120 r/min培養24 h，取出菌液，置4 ℃，備用。

1.5 抑菌試驗

1.5.1 指示菌抑菌平板制備

取熔化后冷卻至50～56 ℃LB瓊脂，取指示菌液，加每平皿約20 μL，澆注平板，風干表面凝集水，備用。

1.5.2 紙片抑菌法

取出待測枯草芽孢桿菌菌液，使用濾紙片（直徑6 mm，121 ℃、20 min 干燥，備用）蘸取被測菌液（約15～20 μL），貼附指示菌平皿表面，以培養基做對照，每株菌做3 皿次重復，置37 ℃，18～24 h 取出，使用游標卡尺計量抑菌圈直徑（mm），記錄結果。

1.5.3 結果判定

參照藥物敏感性判定標準，判定抑菌強度。抑菌圈直徑0 mm判定為“-”；10 mm以下為“+”；10～14 mm為“++”；15～20 mm為“+++”；20 mm以上為“++++”。

2 結果與分析

2.1 試驗分離菌種鑒定（見圖1、圖2）

圖1 12種21株芽孢桿菌16S rDNA序列同源性比較Fig.1 Comparison of 16S rDNA sequence homology of 21 Bacillus strains from 12 species

試驗分離的芽孢桿菌菌種通過分離純化，對16S rDNA 基因片段測序，并與基因BANK 數據庫進行序列同源性比較，并建立試驗菌種（株）系統發育樹。由圖1、圖2可知，分離用于試驗的菌株均為芽孢桿菌。

圖2 12種21株芽孢桿菌16S rDNA序列系統發育樹Fig.2 16S rDNA sequence phylogenetic tree of 21 Bacillus strains from 12 species

2.2 試驗分離鑒定芽孢桿菌種抑菌性比較（見表2、圖3～圖5）

表2 不同來源12種芽孢桿菌抑菌性篩選比較結果Tab.2 Bacteriostatic screening and comparison of 12 Bacillus isolates from different sources

圖3 芽孢桿菌抑菌試驗（1）Fig.3 Bacteriostatic test of Bacillus(1)

圖4 芽孢桿菌抑菌試驗（2）Fig.4 Bacteriostatic test of Bacillus(2)

圖5 芽孢桿菌抑菌試驗（3）Fig.5 Bacteriostatic test of Bacillus(3)

由表2、圖3～圖5可知，同一菌種，如4株枯草芽孢桿菌之間抑菌強度不同，枯草芽孢桿菌07 和16 對金黃色葡萄球菌的抑菌強度達到“++++”，但對大腸桿菌的抑菌強度較弱僅達到“++”；其他菌種，如海氏芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌的2株菌的抑菌強度也有差異。不同菌種之間抑菌強度差異明顯，尤其是對大腸桿菌的抑菌強度更為突出。枯草芽孢桿菌07 菌株、枯草芽孢桿菌16 菌株、貝萊斯芽孢桿菌02 菌株和韋氏芽孢桿菌A菌株對金黃色葡萄球菌抑菌強度達到“++++”，對大腸桿菌的抑菌強度達到“++”以上。芽孢桿菌sp.菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌強度達到“+++”。

3 討論

枯草芽孢桿菌作為益生菌飼料添加劑已納入農業農村部飼用益生菌名錄，并得到廣泛應用[8]。根據益生菌飼料添加劑研發、生產和應用的實踐認為，芽孢桿菌的不同菌種抑菌強度也不同。本試驗對不同來源的芽孢桿菌種的抑菌試驗比較也證明了上述觀點。周映華等[9]對3株芽孢桿菌進行生理功能分析，結果表明，試驗用3種芽孢桿菌對病原菌的抑制效果無顯著差異，因此進一步猜測原因可能是指示菌種類有限，不能清晰反映芽孢桿菌的作用特點，也可能是芽孢桿菌不同菌株的抑菌作用本身就是多方式的。芽孢桿菌多種多樣，其代謝產物也不盡相同，細菌素是許多細菌的核糖體合成肽，可用于對抗致病菌和抗生素耐藥菌[10]，而且細菌素的抗菌機制通常針對與生產者相同或密切相關的物種，作用范圍比較狹窄。然而，芽孢桿菌屬除了核糖體產生細菌素之外，還能產生非核糖體合成的脂肽，因而表現出廣譜的抗菌活性[11-12]。因此，上述不同結果可能是由芽孢桿菌代謝產物不同、抑菌作用方式多樣化造成的。

芽孢桿菌是一類公認的抗菌肽產生菌。抗菌肽通過干擾細胞壁的合成或通過在細胞膜上形成孔來對抗靶細胞[13]。芽孢桿菌的抑菌作用強度主要取決于產生抗菌肽的性質和產生量[14-16]。源自芽孢桿菌的抗菌肽，因其廣譜抗菌能力以及較為高效的活性而備受關注。本試驗通過培養條件、培養基篩選或單菌多次級代謝策略比較篩選出4種（5株）芽孢桿菌所產生的抗菌肽具有抑菌性，但是抗菌肽產生量的提高有待于進一步研究。

通過抑菌強度比較的4 種（5 株）芽孢桿菌，其中貝萊斯芽孢桿菌02菌株、韋氏芽孢桿菌A菌株對金黃色葡萄球菌抑菌強度達到“++++”，對大腸桿菌的抑菌強度達到“++”以上。芽孢桿菌sp.菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌強度達到“+++”，使得芽孢桿菌抗菌肽的研究更具重要價值。目前，有報道稱韋氏芽孢桿菌可產生能殺死線蟲的揮發性物質[17]，關于抑菌性的報道較少。有學者研究貝萊斯芽孢桿菌粗提物對于食源性金黃色葡萄球菌的作用，結果表明，貝萊斯芽孢桿菌對于食源性金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用[18]。此外，從青海藏羊瘤胃中分離篩選出的貝萊斯芽孢桿菌對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及產氣莢膜梭菌有較強的抑菌能力，且抗逆性強、生長速度快[19]。有研究者從蝦腸道分離出一些芽孢桿菌菌株，發現芽孢桿菌sp.T-J-1 可有效抑制擬態弧菌Vibrio mimicus、溫和氣單胞菌Aeromonas sobria、副溶血性弧菌V.parahaemolyticusATCC17802、大腸埃希菌Escherichia coli的生長，并認為BacillusspT-J-1在水產養殖中（尤其是蝦的養殖）具備開發利用的價值[20]。綜上所述，本研究與他人的研究結果基本一致。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別為革蘭氏陽性和陰性細菌。相比革蘭氏陽性細菌（G+細菌），能有效拮抗革蘭氏陰性細菌（G-細菌）的細菌素更為稀缺。早在2009年，有學者研究發現，枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯[21]，本研究也證明這一觀點。多黏菌素是目前針對G-細菌感染的最后一道防線。對多黏菌素不敏感的超級細菌在世界范圍內多有報道，能抑制G-細菌的海洋細菌素有可能成為多黏菌素的替代方案[22]。本研究為益生素菌株應用和芽孢桿菌抗菌肽研發的候選菌株選擇奠定基礎。

4 結論

枯草芽孢桿菌07菌株、枯草芽孢桿菌16菌株、貝萊斯芽孢桿菌02 菌株和韋氏芽孢桿菌A 菌株對金黃色葡萄球菌抑菌強度達到“++++”，對大腸桿菌的抑菌強度達到“++”以上。芽孢桿菌sp.菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌強度達到“+++”，對大腸桿菌的抑菌強度也達到“+++”。對于芽孢桿菌，同一菌種的不同菌株抑菌強度不同；不同菌種之間，抑菌強度差別明顯，并且不同菌種對大腸桿菌的抑菌強度尤為突出。