氣相色譜法測定葡萄酒中甜蜜素的條件優化

鄒大松，向雅潔，鄒昌新

（1.公安縣公共檢驗檢測中心，湖北 荊州 434300 ；2.松滋市公共檢驗檢測中心，湖北 松 滋 434200；3.松滋市劉家場鎮畜牧獸醫技術服務中心，湖北 松滋434217；4.松滋市農業農村局，湖北 松滋 434200）

甜蜜素的化學名稱為環己基氨基磺酸鈉，化學式為C6H11NHSO3Na，于1937 年被Sveda 發現。由于其甜度遠高于蔗糖，于是早在1950 年就被當作食品甜味劑推廣使用[1-4]。但是關于甜蜜素作為食品添加劑使用是否對人體有害這一課題在國際還沒有定論，部分國家全面禁止食品中添加甜蜜素，還有部分國家則是嚴格限量控制食品中的甜蜜素含量。最新的文獻資料表明，甜蜜素當作食品添加劑來使用被人體吸收后，會給人體骨細胞正常運轉帶來負面影響，尤其是經常攝入富含甜蜜素的食品會對人體（尤其是排毒能力差老幼群體）肝臟系統造成不良影響。

葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經完全或部分發酵釀成的酒精飲料，因其營養價值較高、口感獨特、酒精含量相對白酒要低，故廣受消費者的青睞。近年來，隨著人們對食品安全的日漸關注，相關部門加強了對食品衛生安全的監管，要求各生產企業嚴格按照國家標準控制食品中的各種添加劑用量，并不定期抽檢，曝光了一些不法行為。例如，2019 年河南工商部門對登封市美真宜商貿有限公司崇高路店銷售的馬峪川甜紅葡萄酒進行檢測，查出甜蜜素含量超出國家限量標準。

目前測定食品中甜蜜素含量的方法很多，主要有氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法、重量法等[5-8]。研究采用氣相色譜法測定葡萄酒中甜蜜素含量，對樣品前處理條件進行了優化，以期為同類樣品的甜蜜素分析測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器Agilent 7890B 氣相色譜儀，帶FID的檢測器，美國安捷倫公司；UPH 超純水機，成都優普公司；GZX-101-1-BS 電熱恒溫鼓風干燥箱，深圳博泰公司；UMV-1 渦旋振蕩器，北京優晟公司；204E 天平，規格0.000 1 g，美國梅特勒托利多公司。

1.1.2 試驗試劑甜蜜素標準溶液，BW12371-1，含量1 000 mg/mL，北京萬佳首化生物科技有限公司；硫酸，優級純，中國醫藥集團有限公司；亞硝酸鈉，分析純，中國醫藥集團有限公司；氫氧化鈉，分析純，中國醫藥集團有限公司；正庚烷，分析純，中國醫藥集團有限公司；氯化鈉，分析純，中國醫藥集團有限公司；葡萄酒（市場購買），275 mL，酒精含量3.5%，香港新動力公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配置將1 000 mg/mL 甜蜜素標準溶液的母液按照GB5009.97—2016[9]中的方法配制成為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L 的梯度標準溶液，備用。

1.2.2 葡萄酒樣品前處理及條件優化（1）水浴除酒精和二氧化碳：用天平準確稱取25.0 g 葡萄酒樣品到燒杯中，先用氫氧化鈉溶液（40 g/L）將葡萄酒樣品的pH 調至7～8；置于60℃水浴中處理30 min，以去除葡萄酒中的酒精與二氧化碳；將水浴后的葡萄酒放置到常溫，用超純水定容到50 mL，備用。（2）衍生化反應：分別向去除酒精和二氧化碳的葡萄酒溶液中加入5.0 mL 正庚烷、2.5 mL 亞硝酸鈉溶液（50 g/L）以及2.5 mL 硫酸溶液，水浴反應30 min；加入2.5 g 氯化鈉，采用渦旋混合器充分混勻；高速離心分層后取上清液待測[10-14]。該研究重點優化了葡萄酒樣品衍生化反應的條件，包括硫酸濃度（50、100、150、200、250 g/L）、水浴溫度（10、20、30、40、50℃）和渦旋振蕩時間（20、40、60、80、100、120 s），得出最佳衍生化反應條件。

1.2.3 色譜參數參考GB5009.97—2016 中色譜條件相關參數，使用DB-1 弱極性毛細色譜柱。檢測器選擇為FID；分流進樣，分流比為30 ∶1；進樣口溫度230℃；進樣量體積為1 μL；色譜柱選擇程序升溫，先以5℃/min 的速度從65℃升溫至85℃，然后以18℃/min 的速度升溫至220℃，在220℃下保持10 min。

1.2.4 方法驗證（1）精密度檢驗：將同1 次葡萄酒樣品連續使用氣相色譜檢測7 次，考察方法的精密度。（2）加標回收率檢驗：在葡萄酒樣品中分別加入100、150 及200 μL 10.00 mg/mL 的甜蜜素標準溶液，按照優化后的衍生化反應條件進行衍生化，然后上機檢測，考察樣品的加標回收率。

2 結果與分析

2.1 衍生化反應條件優化

2.1.1 最佳硫酸濃度從圖1 可以看出，當硫酸濃度在在50～150 g/L 區間內，甜蜜素的峰面積與硫酸濃度呈正相關性，即隨著硫酸濃度的升高，峰面積增加；當硫酸濃度在150～250 g/L 區間內，甜蜜素的峰面積呈緩慢下降趨勢；當硫酸濃度為150 g/L 時，檢測到的甜蜜素峰面積最大。葡萄酒樣品處理中加入硫酸的目的是讓衍生化反應處于有利的酸性環境，同時硫酸能促進葡萄酒樣品中的亞硝酸鈉反應為亞硝酸，并為衍生化反應帶來羥基促進最終產物的合成[15]。試驗結果顯示，當硫酸濃度為150 g/L 時，最有利于甜蜜素衍生反應的進行。

圖1 不同濃度硫酸處理甜蜜素的峰面積

2.1.2 最適水浴溫度由圖2 可知，甜蜜素的峰面積與水浴溫度呈正相關性，即隨著水浴溫度的升高，甜蜜素的峰面積增加；尤其當水浴溫度從10℃上升到30℃時，甜蜜素峰面積增加顯著，而當水浴溫度由30℃上升到50℃時，甜蜜素峰面積增加值趨于穩定。葡萄酒樣品衍生化反應的原理是甜蜜素在酸性環境下先生成環己胺，然后環己胺與亞硝酸反應結合為重氮鹽，但是重氮鹽在溫度較高時容易自我分解生產氮氣[16]。在試驗過程中，當溫度達到30℃及以上時，重氮鹽的結構不穩定，產生大量氣體，溫度越高反應越劇烈，導致葡萄酒樣品的溶液隨著氣體產生形成飛濺，造成樣品中甜蜜素含量的部分損失。因此，葡萄酒樣品前處理法中衍生化反應的最適水浴溫度為30℃。

圖2 不同水浴溫度處理甜蜜素的峰面積

2.1.3 最佳渦旋振蕩時間從圖3 可以看出，甜蜜素峰面積與渦旋振蕩時間呈正相關性，即隨著渦旋振蕩時間的延長，峰面積增加；當渦旋振蕩時間在20～80 s 范圍內時，峰面積與渦旋振蕩時間的相關性較為明顯，渦旋振蕩處理80 s，甜蜜素的峰面積最大；而當渦旋振蕩時間在80～120 s 區間時，峰面積與渦旋振蕩時間的相關性趨于平穩[17]。在實際操作過程中，從節約時間與節省資源的角度考慮，以渦旋振蕩處理80 s，最有利于甜蜜素衍生化反應的進行。

圖3 不同渦旋振蕩時間處理的甜蜜素峰面積

2.2 標準曲線及色譜圖

如圖4 所示，該檢測方法的標準曲線方程為y=5 220.3x+ 989.03，R2=0.999 6 ＞0.995，可以滿足試驗要求。衍生化反應條件優化后，葡萄酒樣品中的甜蜜素色譜峰如圖5 所示，各物質的分離度較好，不存在相互干擾，且峰型完整，甜蜜素的保留時間為5.387 min。

圖4 甜蜜素標準曲線

圖5 葡萄酒樣品的甜蜜素色譜圖

2.3 精密度檢驗

精密度試驗結果顯示，7 次測定的峰面積平均值為10 837.6，標準偏差為475.4，相對標準差為4.4%，小于5%，表明該檢測方法滿足試驗要求。

2.4 加標回收率檢驗

由表1 可知，甜蜜素的回收率在90%～110%之間，符合試驗要求。

表 1 甜蜜素的加標回收率檢驗結果

3 結 論

由于供試葡萄酒樣品種類較為單一，所有樣品中測得的甜蜜素含量均低于儀器與方法的檢出限，為了便于研究的開展，采用樣品加標法[18-20]在購買的葡萄酒樣品中加入了10.00 mg/mL 甜蜜素標準溶液200 μL。

該研究以葡萄酒樣品中的甜蜜素為對象，參考GB5009.97—2016 中的儀器配置、試驗條件、前處理法以及衍生法的相關要求，優化了衍生化反應中的硫酸濃度、水浴溫度和渦旋振蕩這3 個參數。結果表明：葡萄酒樣品中甜蜜素的最佳衍生化反應條件為硫酸濃度150 g/L、水浴溫度30℃、渦旋振蕩時間80 s，采用氣相色譜法獲得的標準曲線為y=5 220.3x+ 989.03，R2=0.999 6 ＞0.995；對同1 樣品進行7 次測定，峰面積的平均值為10 837.6，標準偏差為475.4，相對標準差為4.4%，小于5%，加標回收率在90%～110%之間，表明該研究建立的葡萄酒中甜蜜素含量的氣相色譜檢測方法重現性好、精密度高，符合分析檢測要求，可應用于同類樣品的甜蜜素分析檢測。