細胞遺傳學技術在兒童急性白血病診斷中的應用價值

孫恒娟， 杜成坎， 蔣 慧， 邵靜波， 李 紅， 張 泓

（1.上海市兒童醫院 上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海 200040；2.上海市兒童醫院上海交通大學附屬兒童醫院血液科，上海 200040）

急性白血病（acute leukemia，AL）是造血干細胞惡性克隆性疾病，為發病率占首位的小兒臨床惡性血液腫瘤疾病。AL可以分為兩大類：急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）。主要臨床癥狀為貧血、出血、器官浸潤和感染等，嚴重威脅患兒生命安全[1]。國際上一般通過MICM[綜合形態學（morphology）、免疫學（immunology）、細胞遺傳學（cytogenetics）、分子生物學（molecule biology）]分型對初診惡性血液病患者進行準確診斷與規范治療，以提高患者生存率[2-4]。因此，及時、有效的診斷對于AL患兒的預后和治療具有十分重要的意義。本研究采用常規染色體核型分析和熒光原位雜交技術對140例AL患兒進行檢測，探討聯合檢測對提高白血病染色體異常檢出率的價值。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

選取2017年1月—2018年12月上海市兒童醫院140例AL患兒，其中ALL患兒99例、AML患兒41例。診斷和分型均符合中華醫學會兒科學分會血液學組2014年制訂的《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂）》[5]。抽取患兒3～5 mL骨髓，進行常規細胞遺傳學（染色體核型分析）和熒光原位雜交檢測。

1.2 試劑與儀器

Chang Medium MF/BMC細胞培養試劑（美國irvine scientific公司）、Sigma-Alorich Gs500染液（美國Sigma-Alorich 公司）、Vysis FISH探針（美國Abbott 公司）、CX41、BX51、BX61顯微鏡（日本Olympus公司）、CDS5細胞生成干燥箱（美國 Thermotron 公司），Thermobrite雜交儀（美國Leica 公司）。

1.3 方法

1.3.1 染色體核型分析 采用直接法和24 h法制備染色體標本，根據人類細胞基因組學國際命名體系2016分析二倍體核型20個中期分裂相。

1.3.2 熒光原位雜交檢測 探針分別為ETV6/RUNX1、BCR/ABL1、MLL、PBX1/TCF3、PML/RARα、ETO/AML1、CBFβ、MYC、CCND1/IGH、IGH/BCL2，在熒光顯微鏡下通過DAPI、CY3.5、FITC 與三色融合濾光片觀察樣本的信號，計數300個細胞，如遇信號異常，則加數至500個或更多。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果

99例ALL患兒中，20.2%（20/99）染色體核型正常；45.5%（45/99）核型異常，所有核型異常中，單純數目異常占15.6%（7/45），結構異常占53.3%（24/45），數目及結構均異常占31.1%（14/45）；不完全計數占24.2%（24/99），未見分裂相占10.1%（10/99）。

19.5%（8/41）的AML患兒核型正常，核型異常占75.6%（31/41）；結構異常占64.5%（20/41），數目與結構均異常占35.5%（11/41），不完全計數4.9%（2/41）。

ALL患兒染色體特異性異常包括der（19）t（1：19）12.5%（3/24）、t（9：22）16.3%（4/24）、t（8：14）8.3%（2/24）、t/del（11）（q23）20.8%（5/24）；高超二倍體占35.6%（16/45），中位染色體數為56（正常為52～67），主要是獲得三倍體，其中100%獲得X染色體，以下依次為獲得21號（93.8%）、18號（68.8%）、6號（62.5%）、14和4號（各56.3%）、8號和10號（各31.3%）、17號（31.3%）。AML患兒染色體特異性異常包括t（15：17）及17號染色體數目異常占25.8%（8/31）。產生ETO-AML1融合蛋白的t（8：21）占16.1%（5/31）（高于文獻[6]中12.0%～15.0%的發生率）、t/del（11）（q23）占22.6%（7/31）、inv（16）占9.7%（3/31）。此外，數目與結構均異常占35.5%（11/31），累及染色體X、8、7、21。

2.2 熒光原位雜交檢測結果

ALL患兒熒光原位雜交檢測異常率為80.7%（113/140）（1例患兒多種探針異常只計數1次）。28例染色體核型正常患兒中，熒光原位雜交檢測異常11例（39.3%）；76例核型異常患兒中，熒光原位雜交檢測結果正常11例（14.5%）。ALL患兒中出現幾種探針同時異常的現象，AML患兒則未發現這一現象。熒光原位雜交檢測共檢出異常信號151例次，其中ALL 124例次，AML 27例次。

2.2.1 ALL患兒熒光原位雜交檢測異常特征 ALL患兒熒光原位雜交檢測異常率為86.9%（86/99）。異常信號共124次，ETV6/RUNX11異常信號占50.0%（62/124），PBX1/TCF3異常信號占23.4%（29/124），BCR/ABL1異常信號占14.5%（18/124），MLL檢測t/del（11）（q23）占9.7%（12/124），MYC/IGH占1.6%（2/124），MYC占0.8%（1/124）。

2.2.2 AML患兒熒光原位雜交檢測異常特征 AML患兒熒光原位雜交檢測異常率為65.9%（27/41），低于ALL患兒，其中ETO/AML1占29.6%（8/27）、PML/RARα占29.6%（8/27）、CBFβ/inv（16）占22.2%（6/27），MLL探針檢測t/del（11）（q23）占18.5%（5/27）。

2.3 2種方法聯合檢測結果

染色體核型分析、熒光原位雜交和聯合檢測結果見表1、表2。

表1 ALL患兒染色體核型分析、熒光原位雜交和聯合檢測結果 例

表2 AML患兒染色體核型分析、熒光原位雜交、聯合檢測結果 例

3 討論

本研究140例AL患兒中，ALL占70.7%，與文獻報道的兒童AL主要以ALL為主的結論一致[7]。染色體核型分析結果顯示，核型異常占54.3%（76/140），其中不完全計數占18.6%（26/140），未見分裂相占7.1%（10/140）；結構異常多見。熒光原位雜交檢出80.7%（113/140）的AL患兒信號異常，高于染色體核型分析的異常檢出率。2種技術聯合檢測異常率為88.6%（124/140）。根據染色體異常的出現頻率，發現ALL主要涉及21 、1、6、X、14號染色體，AML主要涉及17、8、6、9、11號染色體，兩者并無相關性。

ALL-B患兒中常見t（12：21）（p13：q22）易位形成ETV6/RUNX1基因改變，因片段小，染色體異常核型分析難以檢測到該異常。本研究在染色體核型正常的20例患兒中發現信號異常16例（80%）；染色體不完全計數的22例患兒中，異常19例（83.4%）；9例染色體無分裂相患兒中，異常5例（55.6%），高于文獻[8-10]中20%～25%的檢出率。

染色體亞二倍體是白血病預后不良的標志之一，而高超二倍體則提示預后較好。本研究ALL患兒中有2例存在染色體亞二倍體，16例存在高超二倍體；AML患兒中有5例存在亞二倍體，未發現高超二倍體。高超二倍體的染色體檢查顯帶常不理想，因此需要通過分子檢測才可以獲得更準確的結果[11]。

染色體結構畸變與特定的FAB亞型及預后密切相關的異常被定義為特異性異常。有80%～90%的AML患兒有特異性的染色體畸變，所以染色體特異性異常具有診斷意義[12]。本研究有8例作為AML-M3特異性標志的t（15：17）和PML/RARa融合基因異常，提示預后良好，對此類患兒采用全反式維A酸治療有效。本研究中，患兒特異性BCR/ABL1融合基因異常信號占14.5%（18/124），高于文獻中ALL患兒2%～5%的檢出率[13]。

染色體核型分析和熒光原位雜交對AL的診斷、鑒別診斷和分型、預后、治療方案的選擇有著重要作用。雖然染色體核型分析在AL診斷中最為常用，但患兒骨髓取樣困難，或有骨髓干抽，細胞培養后中期分裂相少或制片質量差等情況，易導致核型分析失敗。熒光原位雜交僅用少量骨髓樣本即可培養中期細胞，或無需培養的間期細胞，2～3 d即可報告結果。染色體核型分析對復雜核型的檢出率高于熒光原位雜交，熒光原位雜交雖對探針種類具有依賴性，且覆蓋區域受限，但探針特異性高、假陽性少，能提高畸變類型診斷的準確率[14]。

本研究染色體核型分析異常率為54.3%，熒光原位雜交異常率為80.7%，2種方法聯用異常率為88.6%。

綜上所述，細胞遺傳學檢測技術已成為白血病的分子檢測方法之一，兩者聯合可以提高異常檢出率，提供必不可少的診斷依據，在指導臨床治療與預后判斷中具有重要作用。