長春新堿通過lncRNA XIST/miR-485-5p調控宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的分子機制

劉 宇，李 延，雷玉榮

（陜西省延安市人民醫院婦產科，延安 716000）

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，其發病率與死亡率占據我國女性腫瘤第二位，腫瘤細胞增殖、凋亡異常與宮頸癌形成有關，目前宮頸癌發病機制尚未闡明，因而深入探究宮頸癌的發病機制有助于提高治療效果及改善患者預后。研究表明，中藥治療具有副作用小且療效好等特點，并可成為治療腫瘤的重要方法之一。已有研究證實，小柴堿等具有抗宮頸癌的作用[1-3]。長春新堿是長春花提取物，屬于二聚吲哚類生物堿，其具有抗腫瘤作用，研究表明，長春新堿可抑制結腸癌細胞增殖及促進細胞凋亡[4]。但長春新堿對宮頸癌細胞生物學行為的影響及其作用機制的研究報道較少。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在宮頸癌等腫瘤中異常表達，并可能作為治療的潛在靶點，研究表明，lncRNA XIST 與miR-200a競爭性結合而上調Fus表達從而促進宮頸癌的發展[5]。靶基因預測顯示lncRNA XIST與miR-485-5p存在結合位點，miR-485-5p通過靶向survivin抑制乳腺癌的進展[6]。基于此，本研究旨在探討長春新堿對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及其對lncRNA XIST/miR-485-5p的調控作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 長春新堿購自上海華聯制藥有限公司（純度＞98%）；宮頸癌細胞HeLa購自湖南豐暉生物科技有限公司；DMEM 培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 2000、MTT 試劑、Matrigel 基質膠購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning 公司；miR-NC、miR-485-5p mimics、si-NC、si-lncRNA XIST購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA 購自武漢淼靈生物科技有限公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；反轉錄試劑、SYBR Green 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9 抗體購自美國CST 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 實驗分組 HeLa細胞分別培養于含有不同濃度（0.02 μmol/L、0.04 μmol/L、0.08 μmol/L）長春新堿的培養液培養24 h[7]，分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組。同時將正常培養的細胞作為NC組。pcDNA-NC、pcDNA-lncRNA XIST、miR-NC、miR-485-5p mimics 分別轉染入HeLa 細胞，分別記為pcDNA-NC組、pcDNA-lncRNA XIST組、miR-NC組、miR-485-5p 組。轉染過程參照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書進行操作。分別將pcDNANC、pcDNA-lncRNA XIST、miR-NC、miR-485-5p mimics、miR-NC 與pcDNA-lncRNA XIST、miR-485-5p mimics 與pcDNA-lncRNA XIST分別轉染入HeLa細胞后加入含濃度為0.08 μmol/L長春新堿的培養液培養24 h，分別記為pcDNA-NC+高劑量組、pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組、miR-NC+高劑量組、miR-485-5p+高劑量組、miR-NC+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組、miR-485-5p+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組。

1.3 MTT 法檢測細胞增殖 取對數生長期HeLa細胞（1×106個/mL），接種于96 孔板（100 μL/孔），各孔加入MTT溶液20 μL，于培養箱內繼續培養4 h后棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育5 min后用酶標儀檢測各孔吸光度（OD）值。

1.4 Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲 收集各組HeLa 細胞（2.5×105個/mL）接種于小室的上室（200 μL/孔），小室的下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養液，于培養箱內繼續培養24 h，采用PBS洗滌，加入多聚甲醛固定20 min，采用PBS 洗滌后加入0.1%結晶紫染液染色10 min，觀察遷移細胞數。采用預冷培養液稀釋Matrigel 基質膠后加入上室（40 μL/孔），于培養箱內孵育5 h，后續實驗同細胞遷移實驗，觀察侵襲細胞數。

1.5 qPCR 法檢測細胞lncRNA XIST、miR-485-5p的表達 采用Trizol法提取各組HeLa細胞總RNA，應用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA濃度，逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36個循環。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA XIST、miR-485-5p 相對表達量。XIST 正向引物5’-GTCCCCCAGCAGGCTTTATC-3’，反向引物5’-GAAAAGTGAGTGAAGGAGTA-3’；U6 正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3’，反向引物5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’；βactin 正向引物5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，反向引物5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’；miR-485-5p 正向引物5’-CAGCCAGAGTTAGCAATAGG-3’，反向引物5’-CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT-3’。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測lncRNA XIST 和miR-485-5p 的靶向關系 Starbase 預測顯示lncRNA XIST和miR-485-5p存在結合位點，將含有結合位點的片段克隆至pmirGLO 載體得到野生型載體lncRNA XIST-WT，利用基因突變技術將結合位點進行突變，將含有突變結合位點的片段克隆至pmirGLO載體得到突變型載體lncRNA XIST-MUT，miR-NC、miR-485-5p mimics 分別與lncRNA XISTWT、lncRNA XIST-MUT 共轉染入HeLa 細胞，于培養箱內繼續培養24 h后收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.7 Western blotting 法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達 收集各組HeLa細胞，加入500 μL RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度后，煮沸使蛋白變性，取蛋白樣品（50 μg）進行SDS-PAGE 電泳，蛋白轉移至PVDF 膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液（均1:1 000）后置于4 ℃條件下孵育24 h，采用TBST洗滌后加入二抗稀釋液（1:2 000）后置于室溫條件下孵育1 h，滴加ECL顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 長春新堿抑制宮頸癌細胞HeLa 增殖、遷移和侵襲 與NC 組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞活力（OD）值降低（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數減少（P＜0.05），見表1。

表1 長春新堿抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲

表1 長春新堿抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲

與NC組比較，*P＜0.05。

2.2 長春新堿抑制宮頸癌細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達 與NC組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 Western blotting 檢測宮頸癌細胞CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達

表2 長春新堿抑制宮頸癌細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達

表2 長春新堿抑制宮頸癌細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達

與NC 組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與高劑量組比較，ΔP＜0.05。

2.3 長春新堿對lncRNA XIST 和miR-485-5p 表達的影響 與NC 組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組lncRNA XIST的表達水平降低（P＜0.05），miR-485-5p的表達水平升高（P＜0.05），見表3。

表3 長春新堿對lncRNA XIST和miR-485-5p表達的影響

表3 長春新堿對lncRNA XIST和miR-485-5p表達的影響

與NC組比較，*P＜0.05。

2.4 lncRNA XIST 高表達逆轉長春新堿對宮頸癌細胞HeLa 細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-lncRNA XIST組細胞活力升高（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數增多（P＜0.05），CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC+高劑量組比較，pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組細胞活力升高（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數增多（P＜0.05），CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高（P＜0.05），見圖2、表4。

表4 lncRNA XIST高表達逆轉長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

表4 lncRNA XIST高表達逆轉長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

與pcDNA-NC組比較，*P＜0.05；與pcDNA-NC+高劑量組比較，#P＜0.05。

圖2 Western blotting 法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表達

2.5 miR-485-5p 高表達增強長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用與miRNC組比較，miR-485-5p組細胞活力降低，遷移及侵襲細胞數減少，CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（均P＜0.05）；與miR-NC+高劑量組比較，miR-485-5p+高劑量組細胞活力降低，遷移及侵襲細胞數減少，CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（均P＜0.05），見圖3、表5。

表5 miR-485-5p高表達增強長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

表5 miR-485-5p高表達增強長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與miR-NC+高劑量組比較，#P＜0.05。

圖3 Western blotting檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達

2.6 lncRNA XIST靶向調控miR-485-5p 的表達 Starbase 預測顯示lncRNA XIST 和miR-485-5p存在結合位點，見圖4A。miR-485-5p過表達可明顯降低野生型載體lncRNA XIST-WT的熒光素酶活性（P＜0.05），而對突變型載體lncRNA XIST-MUT 的熒光素酶活性無明顯影響，見圖4B。與si-NC 組比較，si-lncRNA XIST 組miR-485-5p 的表達水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC 組比較，pcDNA-lncRNA XIST 組miR-485-5p 的表達水平降低（P＜0.05），見圖4C。

圖4 lncRNA XIST靶向調控miR-485-5p 的表達

2.7 miR-485-5p 高表達逆轉lncRNA XIST 高表達對長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與miR-NC+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組比較，miR-485-5p+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組細胞活力降低（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數減少（P＜0.05），CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖5、表6。

表6 miR-485-5p高表達可以逆轉lncRNA XIST高表達抑制長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的影響作用

表6 miR-485-5p高表達可以逆轉lncRNA XIST高表達抑制長春新堿對宮頸癌細胞HeLa細胞增殖、遷移、侵襲的影響作用

與miR-NC+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組比較，*P＜0.05。

圖5 Western blotting 法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表達

3 討論

化療、手術等是治療腫瘤的主要方法之一，但部分患者對化療藥物產生耐藥性從而降低治療效果，患者預后較差，既往研究顯示，植物提取物的活性成分具有抗腫瘤的作用，例如，華蟾素可抑制宮頸癌細胞增殖及促進細胞凋亡[8]。苦參堿可通過上調BDNF-AS 而抑制宮頸癌細胞增殖[9]。人參皂苷Rg3 可抑制宮頸癌細胞增殖及上皮間充質轉化[10]。但長春新堿調控宮頸癌細胞生物學行為的作用機制尚未闡明。

長春新堿可通過下調細胞增殖與周期相關蛋白表達而誘導胃癌細胞周期阻滯，并可誘導細胞凋亡[11]。長春新堿可誘導舌癌細胞周期阻滯于細胞中期，并可促進細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，不同劑量的長春新堿處理后可明顯降低宮頸癌細胞活力，并可減少遷移及侵襲細胞數。研究表明CyclinD1屬于細胞周期相關蛋白，其水平升高可促進細胞周期進展，促進細胞增殖[13]。MMP2、MMP9屬于基質金屬酶家族成員，可降解細胞外基質，進而增強細胞轉移能力[14]。為進一步證實長春新堿對宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用，本研究采用Western blot法檢測細胞增殖、遷移及侵襲相關蛋白表達，結果顯示，長春新堿可明顯降低宮頸癌細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9 的表達水平，提示長春新堿可降低宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。

目前長春新堿影響宮頸癌細胞生物學行為的分子機制尚未完全闡明，本研究結果顯示，長春新堿處理的宮頸癌細胞中lncRNA XIST 的表達水平降低，提示長春新堿可能通過下調lncRNA XIST 的表達而發揮作用。lncRNA XIST/ miR-34a 軸通過MET-PI3K-AKT 信號傳導調節甲狀腺癌的細胞增殖和腫瘤生長[15]。lncRNA XIST下調表達通過激活miR-335/SOD2/ROS信號途徑介導的細胞凋亡而抑制非小細胞肺癌的發展[16]。lncRNA XIST 通過miR-133a/EGFR 促進胰腺癌細胞增殖[17]。本研究結果顯示，lncRNA XIST 過表達后可明顯提高宮頸癌細胞活力，遷移及侵襲細胞數增多，lncRNA XIST過表達與長春新堿聯合作用后宮頸癌細胞活力升高，遷移及侵襲細胞數增多，提示lncRNA XIST 過表達可明顯降低長春新堿對宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用。本研究證實lncRNA XIST 可競爭性結合miR-485-5p，并可負向調控miR-485-5p的表達。LncRNA LINC00460 通過調節LINC00460/miR-485-5p/ Raf1 軸而促進甲狀腺乳頭狀癌的進展[18]。miR-485-5p通過靶向CX3CL1抑制骨肉瘤細胞轉移和增殖[19]。miR-485-5p 通過阻斷WBP2/Wnt 信號通路抑制肝癌的進展[20]。本研究結果顯示，長春新堿處理的宮頸癌細胞中miR-485-5p的表達水平升高，進一步研究顯示，miR-485-5p 過表達可明顯降低細胞活力，降低遷移及侵襲能力，miR-485-5p 過表達與長春新堿聯合作用后細胞活力降低，遷移及侵襲細胞數減少，提示miR-485-5p 過表達可明顯增強長春新堿對宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用。分析其原因可能為長春新堿可降低宮頸癌細胞中lncRNA XIST 的表達水平，lncRNA XIST 可競爭性結合miR-485-5p 而負向調控miR-485-5p 的表達，長春新堿可通過調控lncRNA XIST的表達而上調miR-485-5p 的表達從而發揮作用。同時，本研究采用miR-485-5p過表達、lncRNA XIST過表達與長春新堿聯合處理宮頸癌細胞，結果顯示，細胞活力降低，遷移及侵襲細胞數減少，提示長春新堿可通過調控lncRNA XIST/miR-485-5p 而影響宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的生物學行為。

綜上所述，長春新堿可通過降低lncRNA XIST的表達水平而提高miR-485-5p 的表達水平從而抑制宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲，lncRNA XIST/miR-485-5p 可能作為長春新堿治療宮頸癌的潛在靶點，可為進一步揭示宮頸癌發病機制奠定實驗基礎，還可能為宮頸癌治療藥物的研發提供新方向。