miR-106a-5p通過調(diào)控TLR4表達(dá)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

王維學(xué)，樊小群，豐景斌，符仲秋，陳希躍

（海南省三亞市人民醫(yī)院 1.創(chuàng)傷骨科；2.檢驗(yàn)科，三亞 572000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是常見的自身免疫性慢性關(guān)節(jié)疾病，其滑膜組織異常增生和滑膜炎癥是常見的病理現(xiàn)象，具有極高的致殘率[1-2]。滑膜成纖維細(xì)胞是RA 的主效應(yīng)細(xì)胞，其細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥浸潤等與RA 發(fā)病機(jī)制較為密切，嚴(yán)重可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[3-4]。miRNA是一類長度約為18～22核苷酸的非編碼RNA分子，在進(jìn)化上具有高度保守的特性，越來越多的研究表明，miRNA 可以作為RA 的診斷標(biāo)記物和治療靶標(biāo)[5-6]。有研究結(jié)果顯示，miR-106a-5p在RA患者的多克隆Vγ9Vδ2T 細(xì)胞中低表達(dá)[7]，但是具體機(jī)制尚不清楚。Toll樣受體4（TLR4）是免疫系統(tǒng)的病原微生物的主要受體，Li 等[8]研究結(jié)果顯示，TLR4 在類風(fēng)濕骨關(guān)節(jié)中高表達(dá)，miR-506通過下調(diào)TLR4抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。本研究通過體外培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A，探討miR-106a-5p 對(duì)RA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以及是否可能與TLR4 相關(guān)，旨在為RA 提供新的潛在治療標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

RA滑膜成纖維細(xì)胞MH7A購買于廣州吉尼歐生物公司；胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基購買于Gibco 公司；miR-NC、miR-106a-5p、si-NC、si-TLR4、anti-miR-NC、anti-miR-106a-5p、pcDNA 和TLR4 購買于廣州銳博生物公司；Lipofectamine 2000 試劑盒、TRIzol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于Introvigen公司；Fast SYBR Green Master Mix試劑盒和引物購買上海吉瑪公司；TLR4抗體、PCNA抗體、Bax抗體和Bcl-2 抗體購買于Cell Signal Technology 公司；MTT試劑盒購買于上海碧云天生物；凋亡試劑盒購買于上海貝博生物公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購買于Promega公司。

1.2 樣本收集

本研究中22例RA滑膜組織取自海南省三亞市人民醫(yī)院類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)或切除膝關(guān)節(jié)滑膜組織，其中男13例，女9例，年齡45～85 歲，平均（62.1±9.8）歲；同時(shí)，收集22 例非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者在本院接受膝關(guān)節(jié)損傷或十字韌帶斷裂接受手術(shù)的患者作為對(duì)照組（均無急性或慢性關(guān)節(jié)異常的病史），其中男15例，女7例，年齡43～82歲，平均（61.5±11.3）歲。所有患者在手術(shù)前均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

取出冷凍保存滑膜成纖維細(xì)胞MH7A，復(fù)蘇后在培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置為37 ℃、5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)，滑膜成纖維細(xì)胞MH7A接種至完全培養(yǎng)基內(nèi)（10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基），待細(xì)胞貼壁生長至85%時(shí)，加入胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長期的滑膜成纖維細(xì)胞MH7A，每孔按照1×106/孔接種至6 孔板中，將細(xì)胞分為8 組：miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-106a-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-106a-5p）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-TLR4組（轉(zhuǎn)染si-TLR4）、anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）、anti-miR-106a-5p 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-106a-5p）、miR-106a-5p+pcDNA組（共轉(zhuǎn)染miR-106a-5p和pcDNA）以及miR-106a-5p+TLR4組（共轉(zhuǎn)染miR-106a-5p和TLR4），轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)檢測(cè)miR-106a-5p和TLR4 mRNA的表達(dá)

采用TRIzol 試劑盒提取各組滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 的總RNA，檢測(cè)RNA 濃度和純度后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA 模板，參照Fast SYBR Green Master Mix 試劑盒說明書，以U6 和GAPDH作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt公式計(jì)算miR-106a-5p和TLR4 mRNA的表達(dá)。

1.5 Western blotting檢測(cè)TLR4、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 用于提取總蛋白，加入蛋白裂解液冰上裂解20 min，離心后收集細(xì)胞上清。BCA 法定量檢測(cè)蛋白，在SDSPAGE 處理上樣的蛋白樣品，然后將處理過的蛋白樣品轉(zhuǎn)膜，加入脫脂奶粉室溫下封閉培養(yǎng)2 h，加入TLR4、PCNA、Bax和Bcl-2抗體，4 ℃過夜培養(yǎng)，加入二抗，室溫培養(yǎng)2 h，滴加化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Image J分析目的蛋白。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長期的滑膜成纖維細(xì)胞MH7A，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL 并接種在96 孔細(xì)胞板內(nèi)，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h、72 h 時(shí)，按照MTT 試劑盒說明書，每孔加入5 mg/mL 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔內(nèi)繼續(xù)加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），然后在酶標(biāo)儀570 nm處檢測(cè)每孔的吸光度值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期的滑膜成纖維細(xì)胞MH7A，調(diào)整細(xì)胞密度1×106/mL，然后加入400 μL 1×磷酸鹽結(jié)合緩沖液，隨后按照凋亡試劑盒說明書，加入相應(yīng)的Annexin V-FITC和PI染色液，輕輕混勻在避光處反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-106a-5p 和TLR4靶向關(guān)系

構(gòu)建miR-106a-5p結(jié)合位點(diǎn)的TLR4 3’-UTR野生型熒光素酶載體（TLR4-WT）和突變型熒光素酶載體（TLR4-MUT），然后采用Lipofectamine 2000與miR-NC 或miR-106a-5p 共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h 后，收集滑膜成纖維細(xì)胞MH7A，采用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-106a-5p 和TLR4 在類風(fēng)濕滑膜組織中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，RA滑膜組織中miR-106a-5p表達(dá)明顯降低（P＜0.05），TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增加（均P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-106a-5p和TLR4在RA滑膜組織中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR-106a-5p對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

與miR-NC 組 相 比，miR-106a-5p 組 的miR-106a-5p表達(dá)、細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)明顯增加（均P＜0.05）；48 h 及72 h 的細(xì)胞OD 值、PCNA 和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（均P＜0.05），見圖2和表1。

表1 過表達(dá)miR-106a-5p對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

表1 過表達(dá)miR-106a-5p對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

圖2 過表達(dá)miR-106a-5p對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

2.3 干擾TLR4 對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 增殖和凋亡的影響

與si-NC 組相比，si-TLR4 組的TLR4 mRNA 及蛋白表達(dá)、48 h及72 h的細(xì)胞OD值、PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（均P＜0.05）；細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)明顯增加（均P＜0.05），見圖3和表2。

表2 干擾TLR4對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

表2 干擾TLR4對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

圖3 干擾TLR4對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

2.4 miR-106a-5p靶向TLR4的表達(dá)

通過Starbase 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)顯示,miR-106a-5p 和TLR4 存在互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4A。與miR-NC 組相比，miR-106a-5p 組的TLR4-WT 熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而TLR4-MUT 熒光素酶素酶活性無明顯變化，見圖5。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-106a-5p 組中miR-106a-5p 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），TLR4 蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見圖4B和表3。

表3 miR-106a-5p靶向TLR4的表達(dá)

表3 miR-106a-5p靶向TLR4的表達(dá)

圖4 miR-106a-5p靶向TLR4的表達(dá)

圖5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 過表達(dá)TLR4 可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-106a-5p 對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

與miR-106a-5p+pcDNA組相比，miR-106a-5p+TLR4組的TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)、48 h及72 h的細(xì)胞OD 值、PCNA 和Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯增加（均P＜0.05）；細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)明顯降低（均P＜0.05），見圖6和表4。

圖6 過表達(dá)TLR4可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-106a-5p對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

表4 過表達(dá)TLR4可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-106a-5p對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

表4 過表達(dá)TLR4可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-106a-5p對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖和凋亡的影響

3 討論

miRNA 在RA 中差異表達(dá)，通過參與細(xì)胞的增殖、凋亡等發(fā)揮作用，如miR-6089在RA滑膜組織和成纖維樣滑膜細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-6089的表達(dá)明顯抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，miR-6089 通過調(diào)控CCR4 調(diào)控RA 的增殖和凋亡[9]。Li等[10]研究結(jié)果顯示，miR-192在滑膜組織中的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照，過表達(dá)miR-192 可以明顯抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Huang等[11]研究結(jié)果顯示，通過微陣列分析篩選發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p 在成纖維滑膜細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生改變，且通過熒光定量PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miR-26a-5p 在成纖維樣滑膜細(xì)胞中高表達(dá)，抑制miR-26a-5p 可以抑制細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，miR-26a-5p通過激活PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡。miR-199a-3p 在成纖維樣滑膜細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)RB1 可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-199a-3p 對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。Guo等[12]研究結(jié)果顯示，miR-152 在RA 血清、滑膜組織和成纖維樣滑膜細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-152 通過下調(diào)ADAM10抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-106a-5p 在大腸癌、腎細(xì)胞癌和多發(fā)性硬化癥等多種疾病中異常表達(dá)[13-15]，本研究結(jié)果顯示，miR-106a-5p在RA滑膜組織和滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 中低表達(dá)，過表達(dá)miR-106a-5p 可以明顯抑制滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這說明miR-106a-5p可以作為RA的潛在生物標(biāo)志物。

TLR4 屬于跨膜受體家族成員之一，位于9q32-33 染色體上，在啟動(dòng)先天免疫應(yīng)答中至關(guān)重要，而且在多種免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，還可以激活NF-kB、IRF 等基因進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、凋亡等[16-18]。TLR4 多態(tài)性與RA 有關(guān)[19]，miR-146a 通過激活TLR4/NF-kB抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)[20]。鮑曉等[21]研究結(jié)果顯示，利用RNA 干擾沉默TLR4，結(jié)果顯示，TLR4-siRNA可以明顯抑制滑膜成纖維細(xì)胞MH7A的增殖和轉(zhuǎn)移，可能與下調(diào)PCNA、MMP-9和VEGF蛋白有關(guān)。miR-708-5p 可以通過抑制LR4/NF-kB信號(hào)通路誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥損傷[22]。Li 等[23]研究結(jié)果顯示，在RA 患者滑膜成纖維細(xì)胞中，miR-140-5p 低表達(dá)，TLR4 高表達(dá)；miR-140-5p可以結(jié)合TLR4 的3’UTR，miR-140-5p 可以通過調(diào)控TLR4 的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖和炎性因子的分泌，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，TLR4在RA 滑膜組織和滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 中高表達(dá)，干擾達(dá)TLR4可以明顯抑制滑膜成纖維細(xì)胞MH7A的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-106a-5p 可以明顯抑制TLR4-WT 的熒光素酶活性，對(duì)TLR4-MUT熒光素酶活性無明顯變化，說明miR-106a-5p 可以靶向TLR4 的表達(dá)，過表達(dá)TLR4 可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-106a-5p 對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 的增殖和凋亡的影響，說明miR-106a-5p 通過靶向調(diào)控TLR4 進(jìn)而發(fā)揮在滑膜成纖維細(xì)胞MH7A中的作用。

綜上所述，過表達(dá)miR-106a-5p 可以明顯抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)TLR4有關(guān)。