丹酚酸A對心肌梗死大鼠心肌纖維化及心功能的作用及其機制*

石春光，黃 琛，胡益森，蘇天柱，徐 戈△

（1.廣西南寧市武鳴區中醫醫院心血管內科，武鳴 530199；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530001；3.廣西醫科大學第一附屬醫院心血管內科，南寧 530023）

急性心肌梗死是世界上導致患者死亡常見的心血管疾病之一[1]。心肌梗死后常發生心肌重構，是心力衰竭發生和發展的一種病理生理機制[2]。心肌間質纖維化是心肌重構的重要的組成部分[3-4]。轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）能夠調節細胞內Smad 家族轉錄因子，進一步調控纖維化相關基因表達，最終在心肌間質纖維化中發揮重要的調控作用[5-6]。Smad2 作為Smad 家族轉錄因子的重要成員之一，是TGF-β信號通路上關鍵的調控因子[7-8]。研究表明，TGF-β1/Smad2信號通路在心肌梗死大鼠心室重構和心肌纖維化方面發揮重要的調控作用[9-10]。丹酚酸A（salvianolic acid A,SAA）是一種從中藥丹參中提取的有效化合物，具有抗氧化應激、抗細胞凋亡和抗炎癥反應的作用[11-13]。近年來研究表明，丹酚酸A 能夠減輕四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化[14]。然而，丹酚酸A 對心肌梗死大鼠的作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探討丹酚酸A 對心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級成年雄性SD 大鼠，體重（280±10）g，購于廣西醫科大學實驗動物中心。動物生產許可證號：SCXK 桂2020-0003，使用許可證號：SCXK 桂2020-0004。所有動物在室溫25 ℃、相對濕度50%、12 h/12 h晝夜明暗交替的環境中飼養，自由進食和飲水。

1.2 藥物和主要試劑 丹酚酸A 購于北京索萊寶生物科技有限公司。Masson 試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；肌鈣蛋白T 檢測試劑盒、NT-proBNP 檢測試劑盒購于武漢優爾生科技股份公司；CK-MB檢測試劑盒購于南京建成公司。一抗TGF-β1、磷酸化（p-）Smad2、Smad2、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ抗體均購自Abcam 公司；紅外標記熒光二抗購自CST公司。

1.3 實驗分組與造模 將24只大鼠隨機分為假手術組、模型組和丹酚酸A組，每組8只。所有大鼠用戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉后固定在手術臺上，連接心電圖，進行氣管插管，在左胸壁第3與第4肋間剃毛，鋪巾，碘伏消毒，開胸，破心包，在肺動脈圓錐與左心耳之間下2 mm 處穿線，模型組和丹酚酸A 組結扎冠狀動脈左前降支，結扎后心肌呈灰白色，心電圖Ⅱ導聯抬高（振幅>0.2 mV）為心肌梗死造模成功標志。假手術組大鼠僅穿線不結扎。3組大鼠手術后逐層關胸，消毒手術切口，待大鼠蘇醒，繼續正常飼養。造模后，丹酚酸A組腹腔注射10 mg/kg丹酚酸A（溶于生理鹽水）[15-16]，1次/d，連續4周。假手術組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 大鼠心功能檢測 給藥結束后，戊巴比妥麻醉大鼠，固定在動物手術臺上，行右側頸動脈插管，待左室壓力曲線穩定后，通過MPA心功能分析儀檢測大鼠左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室收縮壓力（LVSP）、左心室壓力上升的最大變化率（+dp/dtmax）和左心室壓力下降的最大變化率（-dp/dtmax）。監測3個心動周期，計算各指標的平均值。

1.5 樣本收集 大鼠心功能檢測完畢后，經腹主動脈取血，4 000 r/min 離心20 min，取上清，分裝保存至-80 ℃冰箱。處死大鼠，剪取大鼠心臟，取心肌梗死邊緣區，用預冷的生理鹽水沖洗，快速剪取一部分心肌組織保存于-80 ℃冰箱中，另一部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平 取各組大鼠血清，采用ELISA 法檢測大鼠血清中肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平。檢測過程嚴格按照試劑盒說明說操作。

1.7 Masson 染色檢測心肌纖維化 取各組心肌組織，梯度乙醇脫水，充分浸泡于二甲苯，石蠟包埋，常規切片，行Masson 染色，顯微鏡觀察心肌組織纖維化情況。使用Image J軟件分析纖維化面積，計算藍色區域的面積（纖維化區域）與紅色區域的面積（正常心肌）的比值，即膠原容積分數。

1.8 免疫組織化學染色法檢測心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ纖維化相關蛋白表達 取心肌組織切片，脫蠟，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，3%BSA 室溫封閉30 min，一抗4 °C 孵育過夜，二抗孵育1 h，DAB顯色，復染細胞核，脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機選取5個不連續視野，觀察染色結果，棕黃色顆粒即為陽性細胞。用Image J 軟件測量每張圖片的累積光密度（IOD）以及區域面積，計算平均光密度（AOD），AOD=IOD/面積。

1.9 Western blotting 法檢測心肌組織TGF-β1、Smad2 和p-Smad2 蛋白表達 取心肌組織，加入適量RIPA裂解液，充分研磨，低溫離心，取上清，BCA法檢測蛋白濃度，加熱使蛋白變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗Smad2（1∶1 000），p-Smad2（1∶1 000），β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育過液，洗膜3次；熒光二抗（1∶14 000）室溫孵育2 h，用Odyssey 雙色紅外極光成像儀（LICOR 公司）掃膜。用Image J 軟件分析TGF-β1和p-Smad2蛋白表達水平。

1.10 統計學方法 所有數據使用SPSS 18.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹酚酸A 改善心肌梗死大鼠的心功能 與假手術組比較，模型組大鼠LVEDP 明顯升高，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低（均P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A 組大鼠LVEDP 明顯降低，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯升高（均P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠心功能比較，n=8

表1 3組大鼠心功能比較，n=8

與假手術組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05。

2.2 丹酚酸A 降低心肌梗死大鼠血清心肌肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP 水平 與假手術組比較，模型組血清中肌鈣蛋白T、CK-MB 和NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A組血清中肌鈣蛋白T、CK-MB和NT-proBNP水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組大鼠血清肌鈣蛋白T、CK-MB和NT-proBNP水平比較

2.3 丹酚酸A 降低心肌梗死大鼠心肌膠原容積分數 與假手術組比較，模型組CVF 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A 組CVF 明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 3組大鼠心肌膠原容積分數比較

2.4 丹酚酸A 減少心肌梗死大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達 與假手術組比較，模型組大鼠心肌Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A 組大鼠心肌Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達明顯降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 3組大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達比較

2.5 丹酚酸A 減少心肌梗死大鼠TGF-β1 和p-Smad2 蛋白表達 與假手術組比較，模型組大鼠TGF-β1 和p-Smad2 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸A組大鼠TGF-β1和p-Smad2蛋白表達明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 3組大鼠TGF-β1和p-Smad2蛋白表達比較

3 討論

急性心肌梗死是導致患者死亡的重要心血管疾病之一，其發生后常伴隨心肌重構；心肌間質膠原沉積是心肌重構的重要特征[17]。大多數心肌膠原纖維是由Col-Ⅰ、Col-Ⅲ組成，其中Col-Ⅰ占健康心臟中約80%的膠原蛋白[18]。在正常生理狀態下，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等膠原蛋白的合成和分解處于動態平衡中；然而在某些病理條件下，如心肌梗死發生后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等膠原蛋白的合成多于分解導致過多的膠原蛋白沉積在心肌間質，進而發展成心肌纖維化[19-20]。Qiang 等[21]研究發現，丹酚酸A 能夠預防高脂飲食喂養和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠肝纖維化的病理進展。Zhu等[22]研究發現，丹酚酸A通過SIRT1/HSF1 信號通路減輕內質網應激并防止膽汁淤積誘導的肝纖維化。Pan 等[23]研究發現，丹酚酸A 通過抑制成纖維細胞增殖和促進細胞凋亡來緩解肺纖維化。Chen等[24]研究發現，丹酚酸A能夠改善野百合誘導的肺動脈高壓大鼠的肺動脈重構。本研究結果顯示，模型組血清中肌鈣蛋白T 和CK-MB水平明顯升高，而丹酚酸A組血清中肌鈣蛋白T和CK-MB水平較模型組顯著降低。此外，模型組心肌膠原容積分數、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達升高，丹酚酸A組心肌膠原容積分數、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達較模型組顯著降低，說明丹酚酸A能夠減輕心肌梗死大鼠心肌損傷和心肌纖維化。另有研究表明，過度的心肌纖維化能夠導致心功能異常[25-27]。因此，本研究檢測大鼠心功能和血清中NTproBNP 水平，結果發現，模型組大鼠較假手術組大鼠LVEDP 和血清中NT-proBNP 水平明顯升高，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低；丹酚酸A 組大鼠LVEDP 和血清中NT-proBNP 水平明顯降低，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯升高，這些結果表明丹酚酸A能有效改善心肌梗死大鼠的心功能。

心肌梗死時TGF-β1 被激活，繼而與TGF-β 受體結合，使得下游轉錄因子Smad 活化，進而促進Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等纖維化基因的表達，導致過度的膠原沉積在心肌間質，最終出現心肌纖維化[28-29]。Dai等[30]研究發現，丹酚酸A 能夠下調TGF-β1 表達，抑制Smad2激活，進一步減輕檳榔提取物誘導的口腔黏膜下纖維化。為進一步研究丹酚酸A 抑制心肌梗死大鼠心肌重構的潛在機制，本組檢測了TGFβ1/Smad 信號通路的相關蛋白。結果顯示，模型組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達明顯升高，與模型組比較，丹酚酸A 組TGF-β1 和p-Smad2 蛋白明顯降低，說明丹酚酸A能夠抑制TGF-β1/Smad2信號通路。

綜上所述，丹酚酸A 能夠改善心肌梗死大鼠心肌纖維化，進而改善心功能，該作用可能與抑制TGF-β1/Smad2信號通路有關。