干擾lncRNA SBF2-AS1通過靶向調控miR-582-5p表達抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲*

張平弟，宣 佶，吳永豐

（1.東南大學附屬中大醫院江北院區，南京 210000；2.南京中醫藥大學，南京 210000）

乳腺癌是女性腫瘤中死亡率較高的惡性腫瘤，隨著分子生物學和基因組學的發展以及精準醫學的出現，分子靶向藥物治療成為乳腺癌的一種新型治療方法[1]。靶向治療的關鍵之一在于潛在治療靶點的篩選，研究發現，非編碼RNA（ncRNA）與乳腺癌的發生發展密切相關，可作為乳腺癌的潛在治療靶點[2]。長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding Ribonucleic Acid,lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）均屬于非編碼RNA，與乳腺癌的發生發展、轉移和預后相關，且lncRNAs 可與miRNA、信使RNA（messenger RNA，mRNA）或蛋白相互作用來調節相關基因的表達，從而影響乳腺癌的進展[3]。SBF2 反 義RNA1（SBF2 antisense RNA 1，SBF2-AS1）是一種新的lncRNA，SET結合因子2（set binding factor 2，SBF2）的反義RNA1，干擾SBF2-AS1可抑制宮頸癌細胞的增殖[4]。遠處轉移和復發是乳腺癌患者死亡的重要原因之一，而miRNA的異常表達與乳腺癌的轉移及血管形成等密切相關[5]。生物學軟件預測發現，SBF2-AS1 與miR-582-5p 有結合位點。研究報道，miR-582-5p可抑制骨肉瘤細胞的生長和侵襲[6]，但miR-582-5p 對乳腺癌細胞的影響尚不清楚。本研究旨在研究lncRNA SBF2-AS1 對乳腺癌細胞惡性生物學行為的影響及其機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3、MDAMB-231和正常乳腺細胞MCF10A購自中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640 培養基購自美國Gibco 公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司；Transwell 小室、基質膠購于美國BD 公司；MTT 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養與分組 乳腺癌細胞MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231 和正常乳腺細胞MCF10A 用RPMI-1640 培養基常規培養；取對數生長期乳腺癌細胞MCF-7，分別將miR-582-5p模擬物及陰性對照（NC）、SBF2-AS1 干擾表達載體（siRNA）及陰性對照轉染至MCF-7細胞，記為miR-582-5p組、miR-NC組、si-SBF2-AS1 組、si-NC 組；將SBF2-AS1 干擾表達載體分別與miR-582-5p 抑制劑及陰性對照共轉染至MCF-7 細胞，記為si-SBF2-AS1+miR-582-5p組、si-SBF2-AS1+anti-miR-NC組。

1.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測miR-582-5p和SBF2-AS1 表達水平 收集各組細胞，提取其總RNA，反轉錄成cDNA 后按試劑盒使用說明配制反應體系，進行PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.4 Western blotting 檢測蛋白的表達 提取各組細胞總蛋白，定量后進行SDS-PAGE，轉膜、封閉液封閉，分別加入一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度。

1.5 MTT檢測細胞增殖 各組細胞分別培養24 h、48 h、72 h，加入MTT 溶液，孵育4 h，加入二甲基亞砜，反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度（OD）值。

1.6 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 各組MCF-7細胞消化后用無血清培養液饑餓12 h；遷移實驗：取200 μL MCF-7細胞懸液于Transwell上室，常規培養24 h后用0.1%結晶紫染色液染色10 min，顯微鏡下隨機選取5 個視野拍照并計數。侵襲實驗：Transwell上室加入基質膠，其余同遷移實驗。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗 構建含有miR-582-5p結合位點的SBF2-AS1野生型和突變型熒光素酶表達載體，將其分別與miR-NC 或miR-582-5p共轉染至MCF-7細胞，按試劑盒說明檢測細胞熒光素酶活性。

將si-NC、si-SBF2-AS1、pcDNA、pcDNA-SBF2-AS1 分別轉染至MCF-7，用qPCR 檢測miR-582-5p表達水平。

1.8 統計學方法 采用SPSS 20.00 統計軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA SBF2-AS1 和miR-582-5p 在乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中的表達 與正常乳腺細胞MCF10A相比，乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3、MDAMB-231 中SBF2-AS1 的表達水平顯著升高（均P＜0.05）；而miR-582-5p的表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 SBF2-AS1和miR-582-5p在乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中的表達

2.2 干擾SBF2-AS1 表達對MCF-7 細胞活性的影響 與si-NC組相比，si-SBF2-AS1組MCF-7細胞中SBF2-AS1 的表達水平顯著降低（P＜0.05），Cyclin D1表達水平顯著降低，p21、p27的表達水平顯著升高，MCF-7細胞活性顯著降低（P＜0.05），見圖2、表1。

圖2 干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞活性的影響

表1 干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞活性的影響，n=9

表1 干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞活性的影響，n=9

2.3 干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞遷移、侵襲數目的影響 與si-NC組相比，si-SBF2-AS1組MCF-7細胞中MMP-2、MMP-9、MMP-14 蛋白的表達水平顯著降低，MCF-7細胞中遷移和侵襲數量顯著降低（均P＜0.05），見表2，圖3。

圖3 干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞遷移、侵襲數目的影響

表2 干擾SBF2-AS1 表達對MCF-7 細胞遷移、侵襲數目的影響，n=9

表2 干擾SBF2-AS1 表達對MCF-7 細胞遷移、侵襲數目的影響，n=9

2.4 miR-582-5p 過表達對MCF-7 細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC 組相比，miR-582-5p 組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平顯著降低，p21的表達水平顯著升高，MCF-7細胞活性顯著降低，MCF-7 細胞中遷移和侵襲數量顯著降低（均P＜0.05），見圖4，表3。

表3 miR-582-5p過表達對MCF-7細胞活性、遷移和侵襲的影響，n=9

表3 miR-582-5p過表達對MCF-7細胞活性、遷移和侵襲的影響，n=9

圖4 miR-582-5p過表達對miR-582-5p及相關蛋白表達的影響

2.5 lncRNA SBF2-AS1 靶向調控miR-582-5p 的表達 TargetScan 預測顯示，SBF2-AS1 與miR-582-5p有結合位點，見圖5。WT-SBF2-AS1 與miR-582-5p共轉染后MCF-7 細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），見表4。pcDNA-SBF2-AS1 組miR-582-5p 的表達水平顯著低于pcDNA 組（P＜0.05）；si-SBF2-AS1 組miR-582-5p 的表達水平顯著高于si-NC 組（均P＜0.05），見圖6。

表4 miR-582-5p 與WT-SBF2-AS1 或MUT-SBF2-AS1 共 轉染后的細胞熒光素酶活性，n=9

表4 miR-582-5p 與WT-SBF2-AS1 或MUT-SBF2-AS1 共 轉染后的細胞熒光素酶活性，n=9

圖5 SBF2-AS1的序列中含有與miR-582-5p互補的核苷酸序列

圖6 過表達或干擾SBF2-AS1后miR-582-5p的表達

2.6 抑制miR-582-5p 表達逆轉了干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-SBF2-AS1+anti-miR-NC組相比，si-SBF2-AS1+antimiR-582-5p組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平顯著升高，p21的表達水平顯著降低，MCF-7細胞活性顯著升高，MCF-7細胞遷移和侵襲數量顯著升高（均P＜0.05），見圖7、表5。

表5 抑制miR-582-5p表達逆轉了干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的作用，n=9

表5 抑制miR-582-5p表達逆轉了干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的作用，n=9

與si-NC組比較，*P＜0.05；與si-SBF2-AS1+anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

圖7 抑制miR-582-5p表達逆轉了干擾SBF2-AS1表達對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的作用

3 討論

癌細胞從原發腫瘤擴散并擴散到身體的遠處部位是轉移性癌癥患者死亡的主要原因，研究乳腺癌的分子機制，以期為進一步研發有效的靶向治療藥物奠定基礎[7]。研究發現，lncRNA 和miRNA 均參與調控乳腺癌的進展，可作為其治療的靶點[8-9]。研究報道，沉默SBF2-AS1 可抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲[10]。SBF2-AS1 在肝細胞癌組織中顯著上調表達，敲除SBF2-AS1 通過調節miR-140-5p/TGFBR1 抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。下調SBF2-AS1 表達抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移[12]。以上研究表明，SBF2-AS1在多種腫瘤中起促癌作用，下調SBF2-AS1 具有抑制腫瘤進展的作用。而SBF2-AS1在乳腺癌中的作用及其對乳腺癌細胞的影響尚不清楚。本實驗先檢測了不同乳腺癌細胞系中SBF2-AS1 的表達水平，結果發現，SBF2-AS1在乳腺癌細胞系中均高表達，且在MCF-7細胞中表達水平最高，故后續實驗均采用此細胞（P＜0.05）。本實驗進一步干擾SBF2-AS1 表達后，MCF-7 細胞活性顯著降低，MCF-7 細胞中遷移和侵襲數量顯著降低（均P＜0.05），說明干擾SBF2-AS1 表達可抑制乳腺癌細胞MCF-7 增殖、遷移和侵襲。提示SBF2-AS1在乳腺癌中也起促癌作用，下調其表達可抑制乳腺癌的進展。

研究發現，miR-582-5p 參與多種癌癥的進展，如上調miR-582-5p抑制膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移及促進細胞凋亡[13]；過表達miR-582-5p 通過下調NOTCH1 抑制非小細胞肺癌細胞的生長和侵襲[14]。此外，miR-582-5p在子宮內膜癌、胃癌中低表達，上調miR-582-5p表達通過靶向AKT3來抑制人子宮內膜癌、胃癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[15-16]。miR-582-5p 還通過靶向Rab27a 抑制人結腸直腸癌細胞增殖、細胞周期進展和侵襲[17]。以上研究表明，miR-582-5p在多種腫瘤中起抑癌作用，可抑制多種腫瘤細胞的惡性生物學行為。本實驗檢測了不同乳腺癌細胞系中miR-582-5p 的表達水平，結果發現，miR-582-5p在乳腺癌細胞系中同樣低表達，且過表達miR-582-5p后，MCF-7細胞活性顯著降低，MCF-7細胞遷移和侵襲數量顯著降低（均P＜0.05），說明過表達miR-582-5p可抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲。提示miR-582-5p 在乳腺癌中發揮抑癌基因作用，與在其他癌癥中的作用相似。此外，本實驗還發現，SBF2-AS1 可靶向調控miR-582-5p的表達，而抑制miR-582-5p 表達可部分逆轉干擾SBF2-AS1 表達對乳腺癌MCF-7 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用（均P＜0.05）。以上結果提示，SBF2-AS1可能通過調控miR-582-5p影響乳腺癌進展。

綜上所述，干擾lncRNA SBF2-AS1可通過調控miR-582-5 抑制乳腺癌MCF-7 細胞的增殖、遷移和侵襲。