超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中勃地龍殘留量的不確定度評定

趙盼 馬俊美 郭麗敏

摘 要：建立超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定雞肉中勃地龍的不確定度評價方法，以提高檢測結果的準確性。在建立不確定度評定的數學模型基礎上，尋找檢測過程中各不確定度分量，用統計分析的方法對各分量進行評定，合成標準不確定度，根據概率分布計算擴展不確定度。結果表明：校準曲線擬合和標準溶液配制對不確定度的貢獻最大;當雞肉中勃地龍殘留量為7.425 μg/kg時，其擴展不確定度為0.754 μg/kg（k=2）。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜;雞肉;勃地龍;不確定度

Uncertainty Evaluation for the Determination of Boldenone Residues in Chicken by Ultra-High Performance

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin*

（Hebei Food Inspection and Research Institute， Hebei Food Safety Key Laboratory， Shijiazhuang 050227， China）

Abstract： In order to improve the accuracy of the detection of boldenone in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， a method for uncertainty evaluation was established. Based on the established mathematical model for uncertainty evaluation， the uncertainty components arising from the analytical process were determined and evaluated by statistical analysis. The standard uncertainty was synthesized， and the extended uncertainty was calculated according to the probability distribution. It was found that calibration curve fitting and standard solution preparation made the greatest contribution to the uncertainty. When the boldenone residue in chicken was 7.425 μg/kg，

the expanded uncertainty was 0.754 μg/kg （k = 2）.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; chicken; boldenone; uncertainty

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）10-0048-06

引文格式：

趙盼， 馬俊美， 郭麗敏. 超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中勃地龍殘留量的不確定度評定[J]. 肉類研究， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin. Uncertainty evaluation for the determination of boldenone residues in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125.? ? http：//www.rlyj.net.cn

興奮劑是國際奧委會對運動員禁用藥物的統稱，使用興奮劑會對人體身心造成嚴重的危害。目前國際奧委會將興奮劑分為7 大類，其中合成類固醇又稱蛋白同化激素、通化激素等，是目前使用最廣的一類興奮劑。它們能促進畜禽生長，有利于蛋白質沉積，在畜牧業養殖中使用較為廣泛。但食用含有合成類固醇激素殘留的動物食品會危害人類身體健康，因此，世界各國對合成類固醇激素采取禁用或限用，我國在動物食品抽檢中多次檢出類固醇激素殘留，影響我國該類食品的出口。勃地龍又叫勃地酮、寶丹酮或去氫睪酮，分子式為C19H26O2，是合成類固醇激素的一種。世界反興奮劑機構發布《2018年禁用清單國際標準》，該清單明確規定勃地龍為禁用物質。因此，準確檢測動物源性食品中勃地龍殘留量具有重要意義[1-3]。

在檢測分析中，由于受檢測儀器、檢測方法及實驗誤差的影響，檢測值往往偏離真實值。如何判定檢測結果真實有效，不確定度是一個重要的參考指標。對檢測過程中可能存在的不確定度進行評價可提高檢測結果的準確度，避免因檢測標準的完善性及實驗人員操作的準確性不足對檢測結果造成影響，從而得到更加真實客觀的檢測結果[4-5]。本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定雞肉中勃地龍的不確定度，通過分析實驗中的不確定度來源，對各因素進行評定和合成，最后計算出測量值的擴展不確定度[6-7]，為雞肉中勃地龍檢驗檢測結果評定提供一定的指導，同時為測量其他激素殘留量的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉基質購自石家莊市農貿市場。

勃地龍（純度≥98%）、睪丸酮-D3（100 μg/mL） 北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Triple Quad 6500 UPLC-MS/MS（配有電噴霧離子源）、Analyst?（Version 1.6）、MultiQuant（Version 2.1）軟件 美國Sciex公司;PL203/ME204E電子天平

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;CR22N高速冷凍離心機 日本Hitachi公司;P300H超聲波清

洗器 德國Elma公司;Vortex Genius 3旋渦混合器 德國

IKA公司;有機尼龍微孔濾膜（0.22 μm） 天津艾杰爾公司;ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取1.0 mg勃地龍標準品于10.0 mL容量瓶內，用甲醇定容，配制成質量濃度100 μg/mL標準儲備液，用移液槍準確吸取1 mL標準儲備液到10 mL容量瓶內，用甲醇定容，配制成10 μg/mL中間標準溶液。準確吸取100 μg/mL睪丸酮-D3標準溶液500 μL到5.0 mL容量瓶內，用甲醇定容，配制成質量濃度為10 μg/mL內標儲備液。

用移液槍分別吸取10、20、50、100、200、1 000 μL中間標準溶液到100.0 mL容量瓶內，再分別加入100 μL內標儲備液，用乙腈-水（1∶1，V/V）定容，配制成1、2、5、10、20、100 ng/mL標準工作溶液，內標工作液質量濃度均為10.00 ng/mL，上機測試。

1.3.2 樣品前處理

提取：稱取（5.00±0.05）g試樣，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 μg/mL內標工作液2 μL，加入碳酸鈉溶液3 mL和叔丁基甲醚25 mL，均質30 s，振蕩10 min，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至梨形瓶中，將離心殘渣用25 mL叔丁基甲醚重復再提取1次，合并上清液。

凈化：將上清液轉移至50 mL梨形瓶，于40 ℃水浴中旋轉蒸發至干。用2.0 mL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）溶解殘余物，漩渦混勻后，溶液冷凍30 min，16 000 r/min離心5 min，取適量溶液經0.22 μm濾膜過濾至樣品瓶中，供上機測定。

1.3.3 檢測條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相A：體積分數0.1%甲酸-水溶液;流動相B：乙腈;梯度洗脫;流速0.25 mL/min;進樣量1.0 μL;柱溫30 ℃。洗脫程序：0～1.00 min、20% B，1.00～3.00 min、20%～90% B，3.0～4.5 min、90% B，4.51～6.00 min、20% B。

質譜條件：電噴霧離子源正離子模式，毛細管電壓5 500 V，多反應監測模式，離子源溫度550 ℃，氣簾氣壓力25 psi，輔助加熱氣壓力（GS1）50 psi，輔助加熱氣壓力（GS2）50 psi。

1.3.4 數學模型建立

按照農業部1031號公告-1-2008《動物源性食品中11 種激素殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》，樣品中勃地龍殘留量按下式計算。

式中：X為樣品中勃地龍殘留量/（μg/kg）;ρ為通過峰面積根據標準工作曲線中計算出的上機樣液中檢測物質量濃度/（ng/mL）;V為上機樣液最終定容體積/mL;m為試樣質量/g;n為樣品制備過程中的稀釋因子。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據檢測過程和數學模型分析，對影響勃地龍檢測結果的各不確定度分量來源進行評估，不確定度的來源主要有標準溶液配制、校準曲線擬合、樣品稱量、樣品提取、凈化過程、樣品定容、樣品重復性檢測、儀器設備等[8-9]，詳見圖1。

圖 1 UPLC-MS-MS 檢測勃地龍過程中的不確定度來源

Fig. 1 Uncertainty sources in the determination of boldenone by UPLC-MS-MS

2.2 不確定度評定

2.2.1 標準溶液配制產生的相對不確定度urel（C）

標準溶液配制產生的不確定度有：標準物質純度產生的不確定度u（C1）、標準物質稱量產生的不確定度u（C2）、標準溶液移取產生的不確定度u（C3）和標準溶液定容產生的不確定度u（C4）[8]。

2.2.1.1 標準物質純度產生的不確定度u（C1）

勃地龍標準品純度為98.8%，擴展不確定度為1%，包含因子k=2（證書給出），取正態分布[10-12]，由勃地龍標準品純度產生的標準不確定度為，相對標準不確定度。

睪丸酮-D3標準溶液質量濃度為100 μg/mL，擴展不確定度為3%，包含因子k=2（證書給出），取正態分布，由睪丸酮-D3標準溶液質量濃度產生的標準不確定度為 μg/mL，相對標準不確定度。

綜上，由標準物質純度產生的相對標準不確定度。

2.2.1.2 標準物質稱量產生的不確定度u（C2）

用十萬分之一電子天平稱取1.00 mg勃地龍標準品，該天平檢定證書給出示值誤差的檢定結果為-0.02 mg，取均勻分布[13-15]，其標準不確定度，其相對標準不確定度。

2.2.1.3 標準溶液移取產生的不確定度u（C3）

使用移液器吸取儲備液和中間液，檢定證書給出相應的容量相對誤差[16]，取均勻分布[17-19]，標準溶液移取產生的相對標準不確定度。（V1、V2均為移取液體體積）標準溶液移取過程中產生的不確定度見表1。

標準溶液移取產生的相對標準不確定度為。

2.2.1.4 標準溶液定容產生的不確定度u（C4）

標準溶液定容產生的不確定度有容量瓶容量允差產生的不確定度u（C容量瓶）和甲醇、乙腈-水（1∶1，V/V）定容液體積膨脹產生的不確定度u（C體積膨脹）[20-22]。

容量瓶（A級）經計量檢定合格，容量允差按照JJG 196—2006《玻璃儀器檢定規程》[23]執行，服從三角分配[8，24]，溫度差忽略不計，由容量瓶容量允差產生的相對標準不確定度（表2），其相對標準不確定度。

本實驗在21.8 ℃環境下操作，勃地龍儲備液和中間液分別用甲醇定容至10 mL、內標儲備液用甲醇定容至5 mL，工作液均用乙腈-水（1∶1，V/V）定容至100 mL，甲醇體積膨脹系數為β甲醇=1.1×10-3，乙腈體積膨脹系數β乙腈=1.37×10-3，水體積膨脹系數β水=2.1×10-3，服從均勻分布，溫度差ΔT為1.8 ℃，根據公式，計算得甲醇體積膨脹產生的相對標準不確定度為urel（C甲醇體積膨脹）≈0.001 14，乙腈-水體積膨脹產生的相對標準不確定度為urel（C乙腈-水體積膨脹）≈0.001 80。定容液體積膨脹產生的不確定度為

標準溶液定容產生的相對標準不確定度

因此，標準溶液配制產生的不確定度。

2.2.2 樣品稱量產生的不確定度urel（m）

樣品稱量使用百分之一電子天平，該檢定證書給出示值誤差的檢定結果為0.01 g，取均勻分布，稱樣量為（5.00±0.05）g，其相對標準不確定度。

2.2.3 樣品定容產生的不確定度urel（V）

樣品定容體積為2 mL，使用1 000 μL移液槍移取2 次，1 000 μL移液槍移取1 000 μL溶液容量相對誤差為0.4%，服從均勻分布，計算方法同2.2.1.3節，樣品定容產生的相對標準不確定度。

2.2.4 校準曲線擬合產生的不確定度urel（A0）

用乙腈-水溶液（1∶1，V/V）將勃地龍中間液分別配制成質量濃度為1、2、5、10、20、100 μg/L標準工作溶液，同時分別加入0.1 mL 10 μg/mL內標工作液，按指定方法條件進行測試，以待測物溶液質量濃度與內標溶液質量濃度的比值為橫坐標，以待測物峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，建立工作曲線[10，18，25]，線性范圍為1～100 ng/mL，采用最小二乘法擬合得到線性回歸方程

Y=bX+a，斜率b=0.191 81，截距a=0.034 69，相關系數r=0.999 26。

對陰性雞肉樣品加標后分別測定6 次，根據標準曲線計算所得樣品檢測結果見表3。

由標準曲線擬合產生的不確定度，其中。

式中：SR表示標準溶液峰面積的標準殘差;n表示對標準溶液的測定次數（n=6），f表示對樣品的測定次數（f=6）;0表示檢測樣品溶液質量濃度除以內標溶液質量濃度的平均值;表示標準工作溶液各質量濃度除以內標溶液質量濃度的平均值;c0表示檢測樣品質量濃度與內標溶液質量濃度的比值;Yi表示標準工作溶液中各質量濃度點檢測的實際峰面積與內標峰面積的比值，ci表示標準溶液質量濃度與內標溶液質量濃度的比值。

經計算得SR≈0.022 1，u（A0）≈0.081 5，則校準曲線擬合產生的相對標準不確定度。

2.2.5 樣品重復性檢測產生的不確定度urel（x）

稱取陰性雞肉樣品6 份，每份質量（5.00±0.05）g，分別添加400 μL 100 ng/mL標準溶液，即加標水平為8 μg/kg，檢測結果見表4。重復性檢測引入的測量不確定度屬于A類不確定度[26-27]，將平均測定值代入貝塞爾公式計算標準偏差≈0.114（其中，n表示測定次數，n=6），則樣品重復性檢測產生的不確定度（n=6），其相對標準不確定度。

2.2.6 樣品提取、凈化過程產生的不確定度urel（R）

目標化合物不能從基質中完全提取，在提取、凈化過程中損失造成的不確定度，用加標回收率方法進行計算[28-29]，加標回收率結果見表4。將平均回收率代入貝塞爾公式計算得6 次檢測結果的標準偏差S（R）≈0.014 2，則樣品提取、凈化過程產生的不確定度，。

計算t值對回收率進行顯著性檢驗，，將t值與95%置信度、（n-1）自由度下的雙側臨界值t0.05/5進行比較，查檢驗表t0.05/5=2.571，t>t0.05/5，表明回收率與100%具有顯著性差異，需采用回收率校正因子對檢測結果進行修正。

2.2.7 UPLC-MS/MS產生的不確定度urel（fQ）

該設備校準證書給出其不確定度u=0.6%，k=2，則。

2.2.8 擴展不確定度和結果表示

根據上述各相對不確定度分量數值計算相對合成標準不確定度urel（y）和合成標準不確定度u，取95%置信度，包含因子k=2，計算擴展不確定度U。

3 結 論

通過分析雞肉中勃地龍殘留量的不確定度，得出當檢測結果為7.425 μg/kg時，在95%置信區間內，其擴展不確定度為0.754 μg/kg。各不確定度分量中，影響較大的有校準曲線擬合、標準溶液配制，其影響大小依次為urel（A0）>urel（C）>urel（x）/urel（R）>urel（V）>urel（fQ）>urel（m），在標準溶液配制中，以標準物質純度和移液器移取引入的不確定度最大。因此，建議在檢測時增加標準曲線的檢測次數，保證標準溶液配制準確可靠，盡量選擇不確定度小的標準物質、容量誤差小的移液器、誤差小的電子天平等設備，提高檢測人員的技術水平和儀器設備的準確性，以減小測量不確定度，確保檢測結果準確可靠。

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收稿日期：2021-05-11

基金項目：河北省市場監督管理局科技計劃項目（2020ZD08）

第一作者簡介：趙盼（1983—）（ORCID： 0000-0001-6883-3058），女，工程師，學士，研究方向為食品質量安全。

E-mail： zhaopanhb@163.com

*通信作者簡介：郭麗敏（1970—）（ORCID： 0000-0003-2191-9916），女，教授級高級工程師，碩士，研究方向為食品質量安全。E-mail： guolimin0311@163.com