山東雞爪綿核桃花粉形態的掃描電鏡觀察

唐貴敏，劉丙花，舒秀閣，梁 靜，趙登超*，侯立群*

（1.山東英才學院，山東濟南251400； 2.山東省林業科學研究院，山東濟南250014）

山東省是我國核桃東部沿海分布區的主要產區之一，濟南市南部山區是山東核桃主產區之一，其核桃栽培歷史已有2 000 多年。目前在濟南市歷城區南部山區高爾鎮、柳埠鎮、仲宮鎮、西營鎮等地均保存大量的百年大樹[1]，該地區典型的核桃品種資源為雞爪綿核桃，其經歷歷代果農長期實生繁殖，座果率高，因結果枝形似雞爪而得名。堅果品質優良，生長勢、抗逆性強，在泰山山脈丘陵山地區大面積栽培，在農民增收致富、美麗鄉村建設和鄉村產業振興中發揮了十分重要的作用。

花粉在植物的花粉囊中發育而成，其生長發育環境相對封閉，受外界環境影響小，為此其形態特征具有很強的遺傳性，是研究植物物種演化和分類的重要依據[2]。國內外的許多學者對棗、油茶、櫻桃、蘋果等樹種的花粉形態進行了觀察，為其品種的分類鑒定、親緣關系及其起源演化等提供了強有力的技術支持[3～5]。在核桃屬植物研究方面，有對核桃科不同樹種[6]、薄殼山核桃[7～8]和新疆早實核桃[9]花粉顯微結構研究的相關報道，其研究結果為核桃或薄殼山核桃品種（系）的分類和鑒定提供了科學依據。目前，關于晚實核桃的花粉形態學研究較少，為此本文選取山東省南部山區特色地方品種‘雞爪綿’核桃為試驗材料，同時與早實核桃品種（系）進行對比分析，通過掃描電鏡觀測對比分析其花粉粒形態結構，分析其差異特征，旨在為山東省‘雞爪綿’核桃種質資源的鑒定及分類提供孢粉學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗的核桃花粉來源于山東省濟南市南部山區典型的雞爪綿核桃優株和早實核桃品種（系）共5 份，其中雞爪綿核桃為3 個優良株系（編號：GW1、GW2、GW3）、新疆早實核桃株系1 個（編號：XW1）和核桃品種‘綠香’。

1.2 試驗方法

2020年3月—4月，于核桃雄花盛花期時采集帶雄花核桃枝條，帶回試驗室后，將核桃枝條于水中進行培養，放置于硫酸紙上，待雄花序自然散粉后，收集花藥，用pH=6.8 的戊二醛固定，并置于4℃冰箱保存、備用。

1.3 電子掃描顯微鏡觀察

將樣品從戊二醛固定液中取出，用0.1 M 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）進行充分漂洗，1%的鋨酸·0.1M 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）室溫（20℃）固定1～2 h，0.1 M 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）再次漂洗，梯度乙醇進行脫水，脫水后放入臨界點干燥儀內進行干燥，于導電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺上進行噴金處理，使用SU3800 掃描電鏡分別觀察不同核桃花粉的形狀、赤道面觀和極面觀特點以及萌發孔、外壁紋飾特點，并拍照。

1.4 數據統計與分析

1.4.1 花粉粒

隨機選取20 粒花粉，進行測定分析，分析軟件：Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville,MD, USA)。測量方法：應用Image-Pro Plus 6.0 軟件以2.5K 20um 標尺為標準，每個樣品共選取多個完整清晰的視野，分別測量其極軸長（μm）及赤道軸長（μm)（見圖1），并計算極軸長與赤道軸長的比值（P/E，表示花粉形狀），極軸長與赤道軸長的乘積(P×E，表示花粉的大小)[6]。結合電鏡顯微標尺長度計算其實際長度，用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。

圖1 核桃花粉掃描電鏡觀測

根據王開發等人[10]對花粉形狀類型的劃分標準（見表1），對不同核桃花粉粒的形狀進行分類。

表1 花粉形狀的分類標準Table 1 Classification criteria of pollen shape

2 結果與分析

核桃花粉形態的掃描電鏡觀察結果（見圖2圖版A～E）所示，通過觀察發現，本試驗中雞爪綿核桃和早實核桃花粉外觀形態相似，花粉粒均以單粒的形式存在；核桃花粉表面均勻分布著顆粒狀雕紋，且較為密集，萌發孔凸出于花粉表面。

圖2 不同類型核桃花粉形態的掃面電鏡觀察結果Figure 2 Observation result of pollen morphology of different Walnuts by SEM

供試材料中，雞爪綿核桃花粉的極軸長 （P）為31.15～32.73 μm，赤道軸長（E）為23.22～25.65 μm；‘綠香’核桃極軸長為32.05 μm，赤道軸長為26.47 μm；新疆早實核桃極軸長較小為30.35 μm，赤道軸長為24.30 μm，雞爪綿核桃的花粉大小為760.19～801.19 μm2，新疆早實核桃為737.31 μm2，‘綠香’核桃最大為849.33 μm2，表2和表3方差分析結果表明，雞爪綿核桃花粉與新疆早實、‘綠香’核桃的極軸、赤道軸和花粉粒大小無顯著差異。

表2 不同類型核桃花粉特征值比較Table 2 Comparisons of the values of pollen morphological characteristics between different walnuts

表3 不同類型核桃花粉形態特征值的方差分析結果Table 3 Variance analysis of the values of pollen morphological characteristics of different walnuts

根據極軸/赤道軸(P/E)值確定不同核桃類型花粉粒的形狀，試驗材料中花粉(P/E)值在1.22～1.41 之間，依據王開發等人[10]對花粉形狀類型的劃分標準，確定試驗材料中花粉形狀類型均屬于長球形。

3 討論與結論

雞爪綿核桃作為山東省特色地方品種，屬于晚實核桃品種類型（嫁接后第4—5年開始結果）、抗病（黑斑病、炭疽病）性強，而新疆核桃表現為早實（嫁接后第2—3年開始結果）、豐產、易感病等特性，兩個核桃類型在我國核桃產業發展中均做出突出的貢獻。毛霞等[6]觀察了核桃科植物的花粉，并根據花粉粒的大小對不同的進化進行分類，發現普通核桃花粉為單粒花粉，屬于中等演化水平。劉壯壯等[7]研究不同薄殼山核桃品種花粉形態，發現不同無性系間體積差異表現顯著，花粉粒形狀均為扁球形，花粉表面呈顆粒狀紋飾，均勻分布著顆粒狀的突起，無性系間表面紋飾差異不明顯。本試驗中雞爪綿核桃和新疆核桃花粉同是單粒花粉，方差分析結果顯示雞爪綿核桃間，并與早實核桃進行對比分析，其花粉大小差異不顯著，且2 個類型核桃表面紋飾均為密集分布的顆粒狀并分布在整個花粉表面，說明其的演化水平相當。

寧萬軍等[9]研究發現新疆早實核桃‘新新2 號’花粉粒性狀為扁球形，其余為近球形，花粉極軸長度在33.55～41.68 μm，赤道軸長度在37.87～43.46 μm，本試驗發現雞爪綿核桃花粉的極軸長為31.15～32.73 μm，赤道軸長為23.22～25.65 μm；‘綠香’核桃極軸長為32.05 μm，赤道軸長為26.47 μm；新疆早實核桃單株極軸長較小為30.35 μm，赤道軸長為24.30 μm，其花粉形狀均為長球形。對比寧萬軍的研究結果，新疆早實核桃在山東省栽培種植后，其花粉表現變小，可能是與品種（系）不同有關，但張延龍等[11]認為花粉粒大小可能與植物生長環境有關系，其花粉粒大小變化也可能是山東南部山區的氣候條件和新疆地區的環境條件差異有關系，下一步可以通過對比分析同一品種的生長表現進行驗證說明。