豬附紅細(xì)胞體與奇異變形桿菌混合感染的診斷與治療

李海蓉，夏九鮮，李建華，郭學(xué)勇，李德勤，張圓嬡

（1.安寧市畜牧獸醫(yī)站，云南安寧 650300；2.昆明市西山區(qū)動(dòng)物防疫檢疫服務(wù)中心，云南昆明 650100；3.安寧市青龍街道辦生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心 650308；4.安寧市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)督站，云南安寧 650300）

豬附紅細(xì)胞體與奇異變形桿菌的混合感染主要在哺乳類動(dòng)物和年齡品種各不相同的豬中傳播感染，但相對(duì)來說豬發(fā)病是最高的，其他哺乳動(dòng)物幾乎不發(fā)病。混合感染病情復(fù)雜，發(fā)病癥狀同其豬瘟等豬的常見病具有相似性，常常被誤診，給治療帶來不便。若診斷不當(dāng)、治療不及時(shí)，豬個(gè)體短期內(nèi)會(huì)發(fā)病病死，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

目前，針對(duì)豬附紅細(xì)胞體和奇異變形桿菌的混合感染的研究相對(duì)較少，也沒有具體治療方法，在預(yù)防和治愈方面還比較薄弱，導(dǎo)致豬傳染率和病死率都較高。本研究提供了診斷和治療方法，可以適當(dāng)預(yù)防和治療此病，降低傳染率和病死率，為研制相應(yīng)的藥物和疫苗提供了參考。

1 材料與方法

1.1 研究背景

2017年2月7日安寧青龍顧建安養(yǎng)豬場(chǎng)爆發(fā)了一場(chǎng)地方性流行疫病，主要表現(xiàn)為，發(fā)病豬精神萎靡、高熱、黃疸、便秘、可視黏膜蒼白、兩耳腫脹發(fā)紺，最后病死。

1.2 研究材料

樣品為豬場(chǎng)送來的豬全血、豬內(nèi)臟。

試劑為2%去氧膽酸鈉溶液、Trizol Reagent試劑、氯仿、丙醇混合溶劑、75%乙醇溶液、dNTP、蒸餾水、10 × PCR buffer、Taq DNA酶、ddH2O、胰蛋白胨氯化鈉溶液、姬姆薩染色液、瑞氏染色液、吖啶橙染色液、RNase抑制劑和AMV-RT。

培養(yǎng)基為血液瓊脂培養(yǎng)基、鳥氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、氧化酶培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫氨酶培養(yǎng)基、脈酶培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、衛(wèi)矛醇培養(yǎng)基、1.5%瓊脂培養(yǎng)基。

試驗(yàn)器材包括PCR儀、EP試管、離心管、移液槍、離心機(jī)、電泳儀、載玻片、顯微鏡、接種針、消毒牙簽、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋等試驗(yàn)器材。

1.3 診斷方法

1.3.1 病豬剖檢

對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行剖檢，觀察病豬的病變部位及病變程度。

1.3.2 直接鏡檢

取適量發(fā)病豬送檢樣品中的豬全血，滴于載玻片上，并在其中加入等量氯化鈉溶液，然后小心蓋上蓋玻片，壓實(shí)。相同步驟制作相同樣品載波片2份以備用，隨機(jī)取制作完成的載波片，在油鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.3 涂片鏡檢

無菌采取正常豬血制作載玻片，作為陰性對(duì)照。對(duì)豬血進(jìn)行姬姆薩染色、瑞氏染色、吖啶橙染色在顯微鏡下觀察。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)

（1）利用病毒核酸提取試劑盒對(duì)豬組織樣進(jìn)行病毒核酸的提取；根據(jù)GenBank中登錄的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為602 bp。反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

（2）反應(yīng)步驟為: 94 ℃ 熱變性5 min，94 ℃變性45 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，做30～35個(gè)循環(huán)。

（3）PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，運(yùn)用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察，針對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描鑒定。電泳檢測(cè)cDNA。將制好的凝膠板水平放入電泳槽，將樣品用移液槍加到凝膠孔中，打開電源將電壓調(diào)節(jié)至120 v，電泳25 min。電泳結(jié)束后在成像分析系統(tǒng)觀察凝膠形成的條帶并記錄結(jié)果，見圖1。

圖1 cDNA電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1.PCR擴(kuò)增樣品；2.陰性對(duì)照）

（4）PCR特異性實(shí)驗(yàn)。用該引物和反應(yīng)條件對(duì)豬支原體、圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒、偽狂犬病毒等基因組和SPF豬血DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證PCR的特異性。

（5）臨床樣品檢驗(yàn)。取豬全血樣品20份，樣品為鮮血涂片鏡檢和臨床癥狀都疑似豬附紅細(xì)胞體感染的，進(jìn)行PCR檢測(cè)。重復(fù)檢測(cè)結(jié)果為假陰性的樣品。當(dāng)檢測(cè)時(shí)，將未加DNA模板的反應(yīng)體系分為2份，1份加陰性樣品DNA，1份加陽性樣品DNA作為對(duì)照。

1.3.5 細(xì)菌培養(yǎng)鏡檢

在無菌條件下，將肝臟組織取適量接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)24～48 h，觀察生長(zhǎng)狀況。挑取單個(gè)長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落進(jìn)行革蘭氏染色并進(jìn)行鏡檢，并富集培養(yǎng)和純化，分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱下培養(yǎng)24～48 h，觀察生長(zhǎng)狀況。

1.3.6 生化實(shí)驗(yàn)

（1）發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。將細(xì)菌培養(yǎng)獲得的菌落用實(shí)驗(yàn)室消毒后的牙簽挑取分別接種到脈酶培養(yǎng)基、氧化酶培養(yǎng)基、賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、衛(wèi)矛醇培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫氨酶培養(yǎng)基、鳥氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、以及葡萄糖培養(yǎng)基之上。然后將其置于恒溫37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

（2）動(dòng)力實(shí)驗(yàn)。取胰蛋白胨的半固體培養(yǎng)試管，用接種針挑取細(xì)菌培養(yǎng)獲得的待測(cè)細(xì)菌，垂直半固體瓊脂表面往下插入，在距離培養(yǎng)試管底部還有5 mm左右時(shí)垂直抽出接種針，若穿刺線周圍有擴(kuò)散生長(zhǎng)，則為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢結(jié)果

解剖后發(fā)現(xiàn)以下幾點(diǎn)病狀，見圖2。

圖2 發(fā)病豬病理解剖圖（a. 內(nèi)臟；b. 腎臟；c.肺；d. 肝臟）

（1）血液顏色為暗紅色且較為稀薄，凝血性下降。

（2）在胸前、腹股等部分的淋巴結(jié)腫大出血，使用手術(shù)刀切割后發(fā)現(xiàn)切面會(huì)流出一定量黑紅色的液體，并伴隨有一定的化膿現(xiàn)象。

（3）心臟積液，心肌出血病變；肝臟腫脹出血，呈棕黃色。

（4）腎臟腫脹出血；肺部腫脹出血，偶見血斑塊；腸系水腫出血，有特殊氣味。

2.2 直接鏡檢結(jié)果

在油鏡下觀察使用豬全血制作的玻片，在紅細(xì)胞和血漿中表面附著一些絲狀體或圓形蟲體，紅細(xì)胞形狀變異，多呈星星狀或鋸齒狀，正常形態(tài)的紅細(xì)胞幾乎沒有，見圖3（a）。

2.3 涂片鏡檢結(jié)果

（1）觀察姬姆薩染色后，紅細(xì)胞邊緣變?yōu)殇忼X狀，酷似菠蘿，不再有圓滑表面；形狀殘缺不全，顏色呈淡藍(lán)紫色，見圖3（b）。

（2）瑞氏染色后觀察細(xì)胞相對(duì)變大，有一些染色相對(duì)較深的顆粒狀物附著于紅細(xì)胞表面或突出部位，見圖3（c）。

（3）在熒光顯微鏡下觀察吖啶橙染色后，紅細(xì)胞多數(shù)變?yōu)榘稻G色，其中并有一些細(xì)小的單體存在，呈現(xiàn)橘黃色，形成強(qiáng)烈對(duì)比，見圖3（d）。

圖3 鏡檢結(jié)果圖（a. 血涂片；b. 姬姆薩染色；c. 雄蟲體前部瑞氏染色；d. 吖啶橙染色）

2.4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，僅豬附紅細(xì)胞體血涂片鏡檢為陽性，其他病原檢測(cè)結(jié)果均為陰性，見表2。

表2 PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 細(xì)菌培養(yǎng)鏡檢結(jié)果

（1）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌菌落呈乳白色，有明顯的遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象。

（2）麥康凱培養(yǎng)基。細(xì)菌菌落整體為圓形扁平狀，細(xì)菌半透明，呈黃褐色，同樣在菌落邊緣具有明顯的遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象。

（3）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。在37 ℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，肉湯變得輕度渾濁。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，肉湯培養(yǎng)基中出現(xiàn)了一定量的絮狀沉淀物。

（4）血瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌菌落呈灰白色，平鋪布滿培養(yǎng)基，有溶血現(xiàn)象，并散發(fā)出一股腐敗性臭味。

（5）將該菌置于光學(xué)顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)該菌形態(tài)多樣，部分呈桿狀，部分呈球狀，無芽孢及莢膜。

圖4 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

2.6 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察整理細(xì)菌接種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)結(jié)果，苯丙氨酸脫氨酶陽性，鳥氨酸脫竣酶陽性，脲酶陽性，發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，見表3。

表3 細(xì)菌接種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察該菌動(dòng)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)穿刺線模糊，于側(cè)光條件下可發(fā)現(xiàn)穿刺線周圍有該菌擴(kuò)散生長(zhǎng)的痕跡，確定動(dòng)力實(shí)驗(yàn)為陽性。

3 治 療

3.1 治療方法

（1）血蟲凈（蘭州正豐制藥有限公司生產(chǎn)）。用量3～5 mg/kg，肌內(nèi)注射或者靜脈注射，每天用藥1次，連用3次（三氮脒有一定毒性，使用時(shí)注意用法用量）。

（2）長(zhǎng)效土霉素（河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。用量0.05 mg/kg，肌內(nèi)注射，每天用藥1次，連用3次。

（3）中藥配方。白術(shù)100 g、干姜50 g、山藥30 g、生姜30 g、大棗30 g、茯苓20 g、車前草10 g混合加水煎煮拌料喂食，每天1次，連續(xù)灌服1周。

3.2 治療結(jié)果

治療3～5 d后，病情得到控制，發(fā)病癥狀緩解，并未見健康豬發(fā)病，豬群進(jìn)食狀況改善，偶見水樣糞便；1周后，無豬感染，發(fā)病癥狀基本消失，豬群進(jìn)食狀況良好，糞便正常。

4 討 論

通過一系列的研究將此次疫病診斷為豬附紅細(xì)胞體和奇異變形桿菌的混合感染，過程嚴(yán)謹(jǐn)并排除實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤的可能性。附紅細(xì)胞豬體感染與很多疾病的臨床癥狀很相似，因此如果只看臨床癥狀無法確診，必須借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。相對(duì)于附紅細(xì)胞體而言，目前沒有好的體外培養(yǎng)方法，難以鑒定病原體。判斷豬是否感染只能對(duì)豬全血樣品涂片染色進(jìn)行鏡檢，但經(jīng)常由于染色劑和一些外在因素的影響，“假陽性”現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)在結(jié)果里，如未成熟紅細(xì)胞的形態(tài)和附紅細(xì)胞體感染后紅細(xì)胞相似，會(huì)導(dǎo)致誤判成陽性。

除此之外，鑒定實(shí)驗(yàn)還經(jīng)常用補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，熒光抗體實(shí)驗(yàn)，間接血凝實(shí)驗(yàn)等。但這些實(shí)驗(yàn)診斷經(jīng)常會(huì)因?yàn)樨i感染了附紅細(xì)胞體后，導(dǎo)致免疫力降低，從而影響血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除此之外，病原也無法徹底準(zhǔn)確的被檢測(cè)出來。研究時(shí)主要采用血涂片鏡檢和RT-PCR進(jìn)行結(jié)合診斷，相對(duì)來說，準(zhǔn)確度更高，結(jié)果更可靠。

近年來，對(duì)于奇異變形桿菌的感染報(bào)道很多在畜牧生產(chǎn)上，但由于對(duì)此菌的研究很少，導(dǎo)致預(yù)防和治療都有很多困難，并且此菌有很強(qiáng)的耐藥性和變異性，目前還沒有藥物可以徹底進(jìn)行治療。而且豬附紅細(xì)胞體發(fā)病后，會(huì)大大降低豬的抵抗力，細(xì)菌性疾病較容易感染。