超臨界流體色譜串聯質譜法研究葡萄中乙蟲腈對映體的選擇性降解

馮躍梁，程有普，郝培培，張彩霞

（1.天津農學院 園藝園林學院，天津 300384；2.天津市綠亨化工有限公司，天津 300270）

市場售賣的農藥中有25%～40%的農藥為手性農藥[1]，在大多數情況下，手性農藥往往以外消旋體的形式生產和使用[2]。當手性對映體暴露在手性環境中或者生物體系中時，通常在生物活性、毒性、代謝、環境行為等方面表現出很大差異[3-6]。所以，僅僅在手性農藥的外消旋體層面上進行風險評估是不夠的，還需要從對映體水平上進行深入研究。

乙蟲腈（1-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯基)-3-氰基-4-乙基亞磺?；?5-氨基吡唑）是一種新型苯基吡唑類殺蟲劑，具有高活性、廣譜性等優點，廣泛用于水稻、蔬菜等多種作物害蟲的防治[7]。乙蟲腈具有1個手性中心，2個對映體，在海藻中R-乙蟲腈優先富集和降解[8]，在水稻田系統中R-乙蟲腈優先降解[9]。目前，雖然有文獻建立了乙蟲腈對映體在蔬菜、水果、土壤中的HPLC分析方法[10]，但是方法的特異性和靈敏度不夠理想，容易造成假陽性[11]。也有學者建立了乙蟲腈對映體在稻米中的HPLC-MS/MS分析方法[12]，較之SFC-MS/MS方法，溶劑的使用量大，對環境不夠友好。

本研究利用超臨界流體色譜串聯三重四極質譜建立了一種高效、靈敏的手性分析方法，采用QuEChERS（快速、簡單、便宜、有效、穩定、安全）方法進行樣品前處理[13]。在此基礎上，系統研究乙蟲腈對映體在葡萄中的對映體選擇性降解，旨在為環境風險評估提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 化學藥品及試劑

乙蟲腈外消旋體標準品（對映體比例1∶1，純度95.6%）由農業農村部農藥檢定所提供，R-乙蟲腈和S-乙蟲腈由上海勤路生物技術有限公司制備（光學純度大于99.0%）。色譜純甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、冰醋酸購買于默克公司，分析純甲醇、乙腈、分析純氯化鈉、分析純無水硫酸鎂購買于天津津科精細化工研究所，超純水是由MilliQ超純水制備系統制備，Pesti-Carb/PSA（500 mg·6 mL-1）、氧化鋁、氨基、PSA、佛羅鋁硅土固相萃取柱（500 mg·6 mL-1）購買于博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 田間試驗

試驗在天津農學院西校區葡萄試驗田中進行。按照NY/T 788—2018《農作物中農藥殘留試驗準則》進行，每個小區50 m2，乙蟲腈（懸浮劑）購買于拜耳作物科學有限公司，有效成分100 g·L-1。按照推薦劑量的1.5倍（60 g·hm-2），于施藥2 h，1、3、5、7、10、14、21、28和35 d取樣。每個樣品取2 kg，四分法取樣，使用組織打碎機打碎，做好標簽，裝袋，放入冰箱中，在-20℃下保存。

1.3 樣品前處理

稱取10.00 g葡萄基質放入50 mL離心管中，加入10 mL1%醋酸乙腈，震蕩15 min，再加入2.0 g氯化鈉和4.0 g無水硫酸鎂，震蕩5.0 min后，在5 000 r·min-1條件下離心5 min。吸取1.5 mL上清液加入預先活化好的PC/PSA柱中（萃取柱用10 mL乙腈進行活化），收集流出液體，加入5 mL洗脫液（甲苯：乙腈=1∶3），進行洗脫，流出液一并收集，用旋轉蒸發儀蒸干流出液體后，加入1.5 mL乙腈復溶，過0.22 μm的尼龍膜，進色譜瓶，檢測。

1.4 儀器條件

采用沃特世（美國）超臨界流體色譜串聯質譜對乙蟲腈對映體進行拆分和檢測。超臨界流體色譜包括UPC2二元溶劑管理器、UPC2樣品管理器、UPC2PDA檢測器、waters補償泵、自動背壓調節器、UPC2柱溫箱，色譜柱CHIRALCEL OD-3手性柱（150 mm×3 mm,3 μm粒徑，大賽璐，日本）。溶劑A（CO2）和溶劑B（異丙醇）的比例為90∶10，進樣量為3 μm、流速為1.8 mL·min-1、柱溫為30℃、樣品溫度為5℃、背壓為400 psi、補償泵流速為0.1 mL·min-1。

質譜條件：ESI(-)離子源檢測目標化合物，采用多反應監測模式（MRM），毛細管電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、錐狀氣體流量和脫溶氣體流量分別為3.5 kV、150℃、500℃、30 L·h-1和800 L·h-1。采用MassLynx NT v.4.1系統操作儀器和數據采集。檢測乙蟲腈的MRM參數見表1。

表1 乙蟲腈對映體的多反應監測參數

1.5 數據分析

乙蟲腈對映體的分離參數包括容量因子（k），分離因子（α）和分離度（Rs），計算公式如下[14]。

式中，t0是使用1,3,5-叔丁基苯測得的保留時間；t為目標化合物的保留時間；w為半峰寬。

用對映體分數（EF）反映乙蟲腈對映體選擇性。計算方法如下[15]。

式中，C(+)、C(-)分別為乙蟲腈的對映體的濃度；EF值范圍為0～1；EF=0.5表示外消旋體。

借助一級動力學方程對葡萄樣品中2種對映體的降解動力學進行擬合，用下列公式確定各個對映體的半衰期。

式中，C0和C表示在0時刻和t時刻對映體的濃度；k代表降解速率常數。

2 結果與分析

2.1 對映體分析條件的優化

2.1.1 有機改性劑的篩選 超臨界流體色譜使用的流動相是二氧化碳，但二氧化碳極性極低，絕大多數情況下，不能將目標化合物洗脫下來。因此，在純的二氧化碳中加入改性劑，有利于提高對目標化合物的分析效果[16]。甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈是在超臨界流體手性分離中常用的改性劑[17]。本研究采用OD-3手性柱，測試了4種改性劑組合驗證對乙蟲腈對映體的拆分效果。SFC的改性劑比例、流速、柱溫、背壓、補償泵流速初次設定分別為10%、1.8 mL·min-1、30℃、2 400 psi、0.1 mL·min-1。如圖1所示，添加10%甲醇或10%乙醇流動相不能使乙蟲腈對映體達到基線分離。將10%乙腈作為改性劑時，乙蟲腈響應值過低。因此，異丙醇作為改性劑效果最為理想。

圖1 4種改性劑對乙蟲腈對映體拆分影響

2.1.2 有機改性劑的比例 在諸多因素中，有機改性劑的比例對分離度、保留時間和分離效率影響最為顯著[18]。從表2得出，當異丙醇的比例從5%增加到20%時，分離度先變大后變小。異丙醇比例為5%和10%時顯然是合適的，由于異丙醇比例為5%時，保留時間相對較晚，因此選擇異丙醇的比例為10%，并繼續對其他條件進行優化。

2.1.3 流速 流速是影響對映體分析效率的另一個重要因素。由于超臨界流體具有粘度低、擴散率高的特點，可以提高流速，減少分析時間，同時不會大幅度降低分析效率。由表2可知，當流速從1.0 mL·min-1增加2.2 mL·min-1時，分析時間明顯提前，但是分離度變化不明顯。隨著流速的增大，壓力顯著增大，但壓力過大會影響手性柱的使用壽命。最終，選擇的流速為1.8 mL·min-1，因為分離度相對較大，分析時間相對靠前，系統壓力不會過大而影響柱效，在此條件下繼續對其他的超臨界流體條件進行優化。

2.1.4 背壓 超臨界流體是依靠背壓調節裝置改變流動相密度來控制保留時間。為了考察背壓對乙蟲腈對映體分離的影響，將背壓從1 600 psi到2 800 psi逐級增加，每次增加400 psi。表2數據表明，隨著背壓的增加，保留時間會縮短，壓力會增加。適當提高背壓會提高分離度，但是過高的壓力會縮短手性柱的使用壽命。綜合考慮，選擇2 000 psi，分離度最高，壓力適中。

2.1.5 柱溫 本試驗在超臨界流體狀態下，柱溫以5℃為增量，從25℃到40℃開始測試。表2數據表明，隨著溫度的增高，保留時間增加，分離度在30℃時達到最高，之后隨著溫度的增加而降低。因為柱溫升高導致流動相密度降低，從而溶解能力降低，保留時間變長[19]。綜合考慮柱溫設定為30℃，保留時間短，分離度好。

2.2 優化凈化和提取程序

提取和凈化程序對于殘留分析來說十分重要。本研究考察了4種提取劑（乙腈、1%甲酸乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈）和5種固相萃取小柱的組合對回收率的影響（回收率的計算方法為樣品峰面積與基質標峰面積之比）。結果如圖2所示，乙腈、1%甲酸乙腈、5%醋酸乙腈作為提取劑時，2個單體之間的回收率差距大。1%醋酸乙腈作為提取劑時，回收率為99.2%～103.9%，符合要求。因此，選擇1%醋酸乙腈作為提取劑。在優化凈化程序的同時，對最佳洗脫液的體積進行確定。當洗脫液的體積為5 mL時，回收率達到了88.4%～100.5%。將1%醋酸乙腈為提取劑，洗脫體積為5 mL時，PC/PSA固相萃取柱的回收率最高，同時色素被有效去除。最終選擇PC/PSA固相萃取柱。

2.3 方法驗證

2.3.1 特異性、線性、最小添加濃度和基質效應在不同的空白基質中提取待測物，來驗證方法可行性和保留時間是否受到干擾。在對映體濃度為10～500 μg·L-1的范圍內確證線性回歸分析。在表3中能夠看到基質標準曲線的最小添加濃度、R2等數據?；|效應被普遍認為是液相色譜串聯質譜分析復雜樣品農藥殘留過程中影響準確度的重要因素之一[20]。本試驗通過基質標準曲線和溶劑標準曲線對比，以葡萄為基質進行研究。當基質效應小于-50%或者大于50%時會被認為強抑制或者增強效果[21]。葡萄的基質效應為-1.55%～+2.93%。本研究使用外標法對葡萄中乙蟲腈對映體的濃度進行了校準，從而獲得準確和真實的檢測結果。

表3 乙蟲腈對映體的線性方程、相關系數、基質效應基質效應和定量限

2.3.2 精密度和穩定性 在空白基質中添加4個不同濃度的乙蟲腈外消旋體（10、20、40、200 μg·kg-1），每個濃度5個重復。用標準偏差值來表示精密度，回收率表示準確性。表4顯示了準確度、精密度和乙蟲腈對映體在葡萄中的回收率。葡萄中日內RSD（n=5）和日間RSD（n=15）值為1.7%～8.8%和2.7%～8.7%（RSD計算方式為標準偏差/算數平均數）。結果表明，這種方法可以對乙蟲腈對映體進行定量分析。

表4 乙蟲腈對映體回收率和相對標準偏差

2.4 乙蟲腈對映體選擇性降解動態

田間試驗結果表明（圖3），葡萄中乙蟲腈對映體濃度在0 d達到最高值，隨著暴露時間的增加，對映體濃度不斷降低。乙蟲腈對映體在葡萄中的降解遵循一級動力學（R2=0.877 6-0.898 2）。結果如表5所示，R-(+)-乙蟲腈和S-(-)-乙蟲腈的半衰期分別為3.23、2.76 d。

表5 乙蟲腈對映體在葡萄的消解動態

圖3 乙蟲腈對映體在葡萄中的消解動態

試驗進一步考察乙蟲腈對映體的選擇性降解。如圖4所示，在0 d時，EF為0.50，之后EF開始降低，EF下降到10 d之后下降趨勢緩解。由此可知，R-(+)-乙蟲腈優先降解，導致S-(-)-乙蟲腈相對富集。

圖4 乙蟲腈對映體的EF值

3 結論與討論

研究手性農藥選擇性環境行為對發展高效低風險農藥具有重要意義[22]。色譜拆分法是手性農藥常用的拆分方法[22]。在以往關于乙蟲腈的研究中[12,21]，乙蟲腈對映體的分析時間長，且產生大量有機溶劑廢液，容易造成資源浪費和對環境產生污染。SFC法中保留時間比HPLC法短，分析效率更高[23]，因此本研究使用超臨界流體串聯質譜法建立手性分析方法，CO2具有無毒、綠色等優點，使用CO2作為流動相，加入異丙醇作為改性劑，能夠提高CO2的洗脫能力，完成對乙蟲腈對映體拆分，達到基線分離，分析時間縮大大縮短，減少有機溶劑的浪費，符合保護環境的初衷。

乙蟲腈殺蟲劑被中國、巴西、日本和越南等多個國家允許在水稻、玉米和大豆等糧食作物上使用[24]。因此，乙蟲腈對映體在農作物中的研究受到大量學者的關注。本研究開展了手性農藥乙蟲腈在葡萄中的消解動態研究，結果發現乙蟲腈對映體在葡萄中存在對映體選擇性，R-(+)-乙蟲腈在葡萄中優先降解，導致S-(-)-乙蟲腈相對富集。原因可能是葡萄中酶或受體對手性化合物對映體的分子識別和生物親和性不同，導致乙蟲腈對映體存在選擇性。已有文獻報道[25]，酶系統在植物體內對多種手性農藥的立體選擇性降解中發揮著關鍵作用，其差異可能與不同植物中涉及農藥對映體降解的微生物種群或酶系統的差異有關。

本研究使用SFC-MS/MS建立了一種靈敏、綠色、高效的手性分析方法，最佳分離條件使用OD-3手性柱，以二氧化碳/異丙醇（90/10，v/v），柱溫30℃，流速為1.8 mL·min-1，背壓為2 000 psi。該方法具有快速、靈敏、穩定、選擇性強等優點，已成功應用于分離和測定葡萄中乙蟲腈對映體。這種快速的方法有助于從對映體角度開展乙蟲腈研究，并最終有助于降低這種殺蟲劑給人類、動物和環境帶來的風險。乙蟲腈對映體選擇性和半衰期也為乙蟲腈單體的制備提供了一定的數據支持，不過本試驗僅研究了乙蟲腈在葡萄中的消解動態，其生物活性、毒性等方面還需繼續研究。