多殺菌素發酵培養基優化及發酵工藝研究

和富明，田杰偉，劉文林，楊傳倫，劉海玉，陳振發

(1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.京博農化科技有限公司，山東 濱州 256500）

多殺菌素(spinosad)是一種由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)通過好氧發酵產生的次級代謝產物。多殺菌素是一種大環內酯類抗生素，不但具有生物農藥的安全性、環境友好性，還具有化學合成農藥的速效性，其作用模式獨特、自然分解快，是一種應用前景廣闊的新型生物農藥[1-2]。多殺菌素也是迄今為止發現的最有效和安全的殺蟲抗生素，在農業生產上和糧食儲藏中均具有良好的應用價值和廣闊的市場前景[3-5]。

目前，國內齊魯制藥有限公司、浙江拜克生物科技有限公司、河北威遠生物化工有限公司等6家公司于2015—2019年取得了多殺菌素的農藥登記證書，但是僅有齊魯制藥有限公司于2020年8月在內蒙古自治區呼倫貝爾市阿榮旗正式投入生產。原因是生產工藝還不成熟，受菌種產素能力不高、發酵水平較低等因素限制，實現工業化生產仍然面臨著生產技術和成本的雙重難題[6-7]。

因此，如何提高產量依然是多殺菌素的研究重點。提高多殺菌素的產量主要從以下兩方面開展工作：一是改變菌株自身的遺傳性狀。陳園等[8]以NTG（亞硝基胍）為誘變劑對刺糖多孢菌進行誘變，最終在誘變劑量2 mg·mL-1、處理時間50 min時獲得產量提高43.96%的多殺菌素高產株；鄔洋等[9]開展的10×MIC濃度的巴龍霉素抗性篩選研究中，抗性突變株的產量是原始菌株的2.2倍；黨福軍等[10]建立了刺糖多孢菌的基因敲除技術（即去除spnK編碼保守區域序列），在工業菌株中構建了spnK失活的突變株，可以大量產生多殺菌素J和L；王海霞[11]通過等離子體誘變結合氯霉素、利福平、鏈霉素和慶大霉素抗生素組合進行多重抗性篩選，獲得了1株高產菌株14-2，其多殺菌素發酵單位比誘變前提高了28.68%。二是通過外部條件的改變調控發酵過程。何思穎等[12]通過對11種常見碳源進行代謝途徑分析，發現以5 g·L-1的甘露糖作為碳源添加時，顯著提高丁烯基多殺菌素的產量1.78倍；鄒球龍等[13]通過pH值調控補料分批發酵生產多殺菌素，其產量可達1.050 μg·mL-1，提高了82%。同時研究人員嘗試添加油脂類、氨基酸類和有機酸類成分來滿足刺糖多孢菌的生長需求，使得產生菌在原有發酵水平上有了較大幅度提高[14-18]。

本研究先利用正交試驗對培養基成分進行優化，然后選擇單因素試驗對發酵工藝進行優化，以進一步提高多殺菌素產量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多殺菌素生產菌株Saccharopolyspora spinosa YJY-12，由黃河三角洲京博化工研究院有限公司精化材料生物研究所生物育種實驗室篩選、保藏。

1.1.2 培養基 斜面培養基：葡萄糖7 g·L-1，飴糖10 g·L-1，酪蛋白胨3 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，MgSO42 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，消前pH值6.9～7.3，121℃滅菌20 min；

種子培養基：葡萄糖10 g·L-1，飴糖10 g·L-1，酵母浸粉20 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，黃豆餅粉15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，MgSO44 g·L-1，消前pH值6.9～7.3，121℃滅菌20 min；

基礎發酵培養基：葡萄糖45 g·L-1，棉籽蛋白30 g·L-1，油酸甲酯30 g·L-1，大豆油15 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，蛋白粉10 g·L-1，玉米漿干粉10 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，(NH4)2SO43 g·L-1，CuSO40.002 g·L-1，(NH4)6Mo7O240.002 g·L-1，FeSO40.002 g·L-1，THIX-298 1 mL·L-1，CaCO35 g·L-1，加水定容至相應體積，滅菌前pH值調至7.3～7.5，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 從-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，接種至固體培養基，30℃培養8 d，活化菌種，形成孢子。

1.2.2 種子液培養 取活化后的平板，刮下孢子，制備孢子懸液，孢子懸液按1%～3%(V/V)的接種量接種至種子瓶培養基，溫度30℃，轉速220 r·min-1，培養至種子液呈土黃色，獲取搖瓶種子液。

1.2.3 搖瓶發酵 將搖瓶中的種子液按照一定比例接種至裝有發酵培養基的搖瓶中進行發酵，溫度30℃，轉速220 r·min-1，培養至240 h，取樣進行多殺菌素含量檢測。

1.2.4 發酵培養基優化 前期通過單因素試驗確定了基礎發酵培養基組成，現通過軟件正交試驗設計助手設計正交試驗L18(37)（如表1所示），對培養基中的各組成含量進行優化。

表1 正交試驗因子與水平設定

1.2.5 種齡優化 分別將培養3～8 d的刺糖多孢菌種子液按照10%的比例接種至裝有基礎發酵培養基的搖瓶中進行發酵，pH值6.5，溫度30℃，轉速220 r·min-1，培養至240 h，取樣進行多殺菌素含量檢測。

1.2.6 接種量優化 將培養3 d的刺糖多孢菌種子液分別按照1%、5%、10%、15%的比例接種至裝有基礎發酵培養基的搖瓶中進行發酵，pH值6.5，溫度30℃，轉速220 r·min-1，培養至240 h，取樣進行多殺菌素含量檢測。

1.2.7 發酵溫度優化 將培養3 d的刺糖多孢菌種子液按照10%的比例接種至裝有基礎發酵培養基的搖瓶中進行發酵，pH值6.5，轉速220 r·min-1，溫度分別為26、28、30、32℃，培養至240 h，取樣進行多殺菌素含量檢測。

1.2.8 發酵pH值優化 將培養3 d的刺糖多孢菌種子液按照10%的比例接種至裝有基礎發酵培養基的搖瓶中進行發酵，用稀鹽酸溶液調節培養基pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，溫度30℃，轉速220 r·min-1，培養至240 h，取樣進行多殺菌素含量檢測。

1.2.9 多殺菌素提取及含量檢測 取發酵液1 mL，加無水乙腈4 mL，充分振蕩30 min，10 000 g離心10 min，取上清液，通過HPLC測定多殺菌素的發酵水平。

液相條件：C18反相柱(250 mm×4.0 mm，5 μm)，流動相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（0.05%乙酸銨水溶液）＝45∶45∶10；流速1.0 mL·min-1，波長250 nm，溫度35℃。

1.3 驗證試驗

按照優化后的培養基配方配制培養基，設為試驗組，接種刺糖多孢菌，應用優化后的培養條件進行培養；同時設置對照組，將刺糖多孢菌接種基礎發酵培養基，同等條件下進行培養；培養至240 h，分別取樣進行多殺菌素含量檢測。

1.4 數據處理與分析

采用正交設計助手進行正交試驗設計及結果分析，運用Origin軟件對單因素試驗結果進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基優化

本研究利用正交設計助手設計了七因素三水平的正交試驗，對基礎發酵培養基的主要成分的含量進行優化，以多殺菌素含量為響應值確定最適培養基配方，試驗結果如表2、表3所示。

表2為試驗結果的直觀分析，表3為試驗結果的方差分析，從不同因素所對應的極差值可以看出，因素A（葡萄糖）對多殺菌素含量影響最大，其次為C（油酸甲酯），其余因素從大到小依次為G（(NH4)2SO4）、F（蛋白粉）、B（棉籽蛋白）、D（酵母粉）、E（玉米漿干粉）。試驗得出優化后的培養基組合為葡萄糖55 g·L-1、棉籽蛋白30 g·L-1、油酸甲酯40 g·L-1、酵母粉10 g·L-1、玉米漿干粉5 g·L-1、蛋白粉15 g·L-1、(NH4)2SO41 g·L-1，發酵后的多殺菌素含量最高可達2.155 g·L-1。

表2 發酵培養基優化正交試驗直觀分析

表3 正交試驗方差分析

2.2 種齡優化

在抗生素等次級代謝產物的發酵中，種齡會對發酵結果產生較大的影響。種齡過高，雖然菌絲量會增加，但種子培養基中養分耗竭而使菌絲逐漸趨于老化，影響接種后其在發酵培養基中的活力，最終會導致產物含量的降低。種齡過低，菌絲量太少，同樣會影響發酵產量。

刺糖多孢菌種齡對多殺菌素發酵產量的影響如圖1所示，刺糖多孢菌種子液培養至第4天時，多殺菌素產量最高，為2.231 g·L-1。種齡3 d的多殺菌素含量為1.356 g·L-1，這說明隨著時間的延長，種子液中的菌體量逐漸提高，且活力較高，接種后能在發酵培養基中迅速生長，縮短延滯期。種齡大于4 d后，多殺菌素產量逐漸降低，尤其是在第8天，多殺菌素產量僅為0.893 g·L-1，此時菌體衰老較為嚴重，影響次級代謝的酶活力，進而引起發酵異常，不利于抗生素的生物合成。

圖1 種齡對多殺菌素發酵產量的影響

2.3 接種量優化

微生物的初始細胞濃度會影響微生物繁殖的啟動時間，較大的接種量有利于微生物快速進入對數生長期，而較小的接種量將會延長微生物生長的延滯期，繁殖啟動較晚，進而影響產物的合成。

刺糖多孢菌接種量對多殺菌素發酵產量的影響如圖2所示，當接種量為5%時，多殺菌素產量最高為2.023 g·L-1。刺糖多孢菌初始接種量過高，菌絲過早生長，消耗培養基中營養成分，影響次級代謝產物的生長，不利于多殺菌素的合成。接種量過低，則會引起發酵前期菌體生長緩慢，使發酵周期延長，導致發酵異常等。

圖2 接種量對多殺菌素發酵產量的影響

2.4 發酵溫度優化

微生物的生長和抗生素的合成等代謝活動都是在各種酶的催化下進行，而酶的催化作用需要有適宜的溫度。從酶反應動力學來說，隨著溫度的升高，酶的活性加強，反應速率加快，生長代謝加快，抗生素分泌期提前，但溫度過高，則會影響酶的活性，菌體迅速衰老，發酵周期縮短，抗生素含量降低。因此維持微生物的生長和抗生素的合成所需要的最適溫度是提高抗生素發酵水平的重要條件[19]。

溫度對多殺菌素發酵產量的影響如圖3所示，刺糖多孢菌發酵產多殺菌素的最適溫度為28℃，多殺菌素產量為2.224 g·L-1。

圖3 發酵溫度對多殺菌素發酵產量的影響

2.5 發酵pH值優化

pH值對刺糖多孢菌發酵產多殺菌素的影響如圖4所示，pH值在6.0～7.0之間時隨著pH值的增加，多殺菌素含量逐漸提高，并在pH值7.0時產量達到最高，為2.145 g·L-1，繼續提高pH值，多殺菌菌素含量略有降低，說明刺糖多孢菌發酵產多殺菌素的最適pH值為7.0。

圖4 pH值對多殺菌素發酵產量的影響

2.6 驗證試驗

優化后的培養基配方：葡萄糖55 g·L-1，棉籽蛋白30 g·L-1，油酸甲酯40 g·L-1，大豆油15 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，蛋白粉15 g·L-1，玉米漿干粉5 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，（NH4)2SO41 g·L-1，CuSO40.002 g·L-1，(NH)6Mo7O240.002 g·L-1，FeSO40.002 g·L-1，THIX-298 1 mL·L-1，CaCO35 g·L-1，加水定容至相應體積，滅菌前pH值調至7.3～7.5，121℃滅菌20 min。

優化后的培養條件：刺糖多孢菌種齡4 d，接種量10%，搖床溫度28℃，轉速220 r·min-1，培養240 h。

利用優化后的培養基和培養條件進行刺糖多孢菌的培養，發酵結束后進行多殺菌素含量測定。如表4所示，對照組多殺菌素含量為1.823 g·L-1，試驗組多殺菌素含量為2.625 g·L-1，優化后多殺菌素含量提高了43.99%。

表4 驗證試驗結果

3 結論與討論

本研究將本實驗室保存的刺糖多孢菌YJY-12用于發酵產多殺菌素的優化試驗，首先通過正交試驗，對基礎發酵培養基中的主要成分進行優化，得到最佳的培養基組成，并得到各組分對多殺菌素合成的影響效果，從大到小依次為葡萄糖＞油酸甲酯＞（NH4)2SO4＞蛋白粉＞棉籽蛋白＞酵母粉＞玉米漿干粉。通過試驗對刺糖多孢菌發酵工藝進行優化，得到最適刺糖多孢菌發酵產多殺菌素的條件為種齡4 d，接種量5%，溫度28℃，pH值7.0。通過驗證試驗比較了對照組與優化后的試驗組的多殺菌素含量，研究結果顯示，對照組多殺菌素含量為1.823 g·L-1，試驗組多殺菌素含量為2.625 g·L-1，優化后多殺菌素含量提高了43.99%。

多殺菌素是一種極具前景的新型農用抗生素，因此，研發成熟的多殺菌素工業化生產工藝具有極重要的意義。張瀚等[20]利用1株通過基因重排獲得的誘變菌株進行試驗，得到影響該菌株發酵生產多殺菌素的最佳油脂為山茶油，且在0 h添加15.0 g·L-1效果最好。通過培養基成分響應面試驗獲得優化發酵培養基，并在5 L的發酵罐中通過補料分批發酵，使多殺菌素產量達到了512.36 mg·L-1，誘變株的多殺菌素產量顯著提高。由以上研究結果可以看出，雖然其發酵水平較低，但卻提供了一種較為全面的研究思路，即對現有菌株進行基因改造，并圍繞發酵培養基中的重要組分進行深入試驗，將有可能使多殺菌素的發酵水平得到新的突破。

本研究為刺糖多孢菌發酵提供了可靠的發酵培養基配方及發酵工藝，實現了多殺菌素增產目標，為加快多殺菌素的工業化生產提供了有益的參考。