竹蓀多糖的提取工藝及其體外抗氧化性研究進展

李宇浩，馬宇軒，羅婷，靳海松，韓偉

（華東理工大學藥學院制藥工程與過程化學教育部工程研究中心，上海市新藥設計重點實驗室，上海200237）

竹蓀（Dictyophora Indusuata）又名竹笙、網紗菌、竹姑娘等，屬于擔子菌亞門（

Basidiomycotina

）、鬼筆科（

Phallaceae

），適合生長在含有大量枯竹殘體和腐殖質的竹林里，我國常見的有長裙竹蓀、短裙竹蓀、紅托竹蓀、棘托竹蓀4個品種，主要分布在四川、云南、福建等地。竹蓀營養價值高，在我國食用、藥用歷史悠久，其在唐代《酉陽雜俎》中就有詳細記載，是“色、味、香、形”四絕的“草八珍”之一，“菌中四珍”之首，素有“山珍之王”“菌中皇后”之稱。在傳統中醫理論中，竹蓀性溫、味甘微苦，對活血益氣、健脾胃、助消化有理想的療效，是食療的重要材料之一。竹蓀含有多糖等多種有效物質。本文論述了竹蓀多糖的提取工藝及其體外抗氧化性，以期為多糖類化合物提取和抗氧化類保健食品的研發提供幫助。

1 竹蓀多糖的藥理作用

在中國傳統中醫藥學理論中，竹蓀性涼，味甘微苦，十二經脈中屬手太陰肺經與足厥陰肝經。《菌譜》《中華本草》等中醫著作記載其有“寧神健體、益氣補腦、潤肺養陰、消炎止痛、清熱利濕”的功效，對于肺虛、熱咳、咽喉炎、風濕、痢疾等癥有明顯的緩解效果。現代科學研究表明，廣泛存在于竹蓀子實體細胞壁中的多糖等具有高活性的大分子物質，在抗腫瘤、抗氧化、抗血栓、增強免疫力等方面具有一定的功效。國外在二十世紀七八十年代就有竹蓀多糖的相關報道。

1.1 抗腫瘤作用

國內外學者對于竹蓀的研究發現，其提取物對腫瘤有一定抑制作用，其主要活性物質為竹蓀多糖。林玉滿等從短裙竹蓀子實體中分離得到多糖Dd、Dd-S3P、Dd-2DE，從長裙竹蓀子實體中純化分離得到多糖DI、DiA、Di-S2P，從棘托竹蓀中分離得到多糖DE2-2，經動物試驗表明，其中Dd、Dd-S3P和DE2-2對小鼠肉瘤S180具有一定的抑制作用，抑制率分別為44.93%、31.3%、38.93%。趙凱等從紅托竹蓀子實體菌提取得到組分DRVP1和DRVP2，其中DRVP1在含量為1.0 mg/mL時，在體外對小鼠S180腫瘤的抑制率高達70%。杜昱光等在對竹蓀深層發酵菌絲提取液進行實驗時發現，其對小鼠S180腫瘤抑制率為40.63%。UKAI等研究發現，竹蓀多糖T-4-N、T-5-N在小鼠體內5 mg/kg用量下即可抑制S180皮下移植瘤的生長，其抑制率為58%。Zhong等發現竹蓀多糖PDI在體外直接抑制S180細胞生長，用5 mg·mL處理S180細胞72 h后，對S180抑制率為13.9%。

1.2 抗氧化作用

關于竹蓀多糖抗氧化性的研究證明，竹蓀多糖不僅在實驗室體外化學體系中具備抗氧化活性，而且在動物實驗中的抗氧化活性也表現良好。Deng等發現長裙竹蓀多糖DIP具有較強的體外還原能力，能夠有效清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基。王蓓蓓等證明在0.2～1.2 mg·mL紅托竹蓀子實體粗多糖和Deng等發現的DIP效果類似，且其體外抗氧化性比BHT稍強，但較維生素C稍弱。Yu等發現棘托竹蓀多糖溶液能夠緩解雙氧水所介導的PC12大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞活力下降癥狀，并減少促凋亡蛋白Bax、半胱天冬酶Caspases-3和細胞色素水平，同時增加抗凋亡蛋白Bcl-2的含量，表明其抗氧化活性可能與抑制細胞凋亡等因素密切相關。

由于氧化脅迫與機體衰老以及神經退行性疾病、癌癥等多種疾病的發生發展有關，并且已經證實某些抗氧化劑的確能夠延緩衰老和防治氧化脅迫相關疾病，因此可以推知竹蓀多糖存在某些和抗衰老、緩解氧化脅迫相關疾病的生物活性。

1.3 免疫調節作用

現代研究表明竹蓀多糖具有免疫調節作用。上世紀UKAI等就已經從長裙竹蓀子實體中得到具有免疫調節作用的直鏈甘露聚糖和葡聚糖。熊彬、郭渝南等經對照研究分別發現，竹蓀菌托菌蓋提取液能修復輻射損傷，促進免疫細胞分化，提高T細胞生長因子指數，激活免疫細胞，修復輻射損傷后的免疫抑制狀態。推測其作用機理，可能是提取液中存在竹蓀多糖，由多糖對生物機體的免疫作用進行調節。徐方等認為真菌多糖參與免疫的功能可能與其對白細胞介素、干擾素的促誘生作用及腫瘤壞死因子有關，也可能與多糖激活T細胞和B細胞的作用有關。杜昱光等則認為是竹蓀多糖作用于免疫系統，明顯提高了大鼠外周血T淋巴細胞的比例，增強了中性白細胞的吞噬能力，同時促進脾臟抗體的合成，從而增強動物的免疫功能。此外，民間傳聞里還有紅托竹蓀可以治療白血病，棘托竹蓀能緩解腳氣的偏方。

1.4 抑菌作用

黃慶斌等實驗發現，竹蓀多糖乙醇醇沉組分對青春雙歧桿菌的增殖有明顯抑制作用，隨著分級醇沉濃度的不斷上升，培養基中青春雙歧桿菌的濃度圖像呈現增大后持續減小的上凸曲線，當分級醇沉濃度達到80%時，抑制青春雙歧桿菌體外增殖的作用最為顯著。盧惠妮、藍蔚青等分別發現棘托竹蓀子實體提取物對單增李斯特菌和副溶血性弧菌有較好抑制作用。羅盛蓮等研究結果證明，棘托竹蓀子實體干粉乙酸乙酯浸膏對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等8種細菌都有明顯的抑制效果。郝景雯等研究表明，長裙竹蓀子實體粉乙醇提取物對細菌有很明顯的抑制作用，而對酵母和霉菌的抑制作用較弱，究其抑菌機理，推測可能是由于竹蓀內多糖物質對細菌細胞的細胞膜的破壞能力較強，從而導致細菌胞膜受損和細胞質溶出，致使其死亡。

2 竹蓀多糖的提取工藝

如何提高竹蓀多糖的得率，降低生產成本，并且不破壞多糖的生物活性，這對于減緩細胞衰老，延長細胞壽命，最終惠及人類、保護人體健康有著不可忽視的意義。竹蓀多糖的提取方法總體有水提醇沉法、酶提取法、超聲波輔助法、壓力輔助法、微波輔助法等。

2.1 水提醇沉法

多糖類物質易溶于水，一般不溶于乙醇、乙醚等有機溶劑。水提醇沉法即為用水為溶劑將多糖進行萃取，再經歷濃縮、乙醇結晶等步驟得到竹蓀多糖。水提醇沉法是多糖提取的基本方法，本文介紹的多糖提取輔助方法均需要與水提醇沉法進行配合使用。

水提醇沉法的本質是將樣品中的有效物質通過浸泡的方法進行提取，是天然物質成分由固至液提取最常見的方法。由于提取劑pH不同，其大致可分為熱水浸提法和酸堿浸提法。熱水浸提法主要提取結合態和非結合態的多糖，本質是萃取技術；酸堿浸提法是通過破壞多糖與其他物質結合的化學鍵，使多糖變為游離態后再進行提取。這其中以熱水浸提法使用較為普遍，但由于成本較高、得率較低且存在污染問題，現在大多不單獨使用水提醇沉法進行多糖提取。

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2.2 酶解提取法

對于竹蓀多糖的提取，使用傳統的水提醇沉法，多糖難以從細胞內釋放出來，從而導致多糖得率低且成本高。而將酶解技術應用于天然產物的提取制備，不僅技術成熟、操作簡便，而且成本較為低廉。葉敏將纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等組成復合酶進行試驗提取竹蓀多糖，發現最佳工藝條件為復合酶濃度1.5%，酶解時間120 min，酶解溫度50℃，pH值4.5，在此條件下多糖得率為7.98%，相較于單一使用水提醇沉法有明顯增加。

2.3 超聲波輔助法

超聲波輔助法是利用頻率在20～50 kHz的機械波，產生空穴效應、熱效應和機械效應而實現的。當其作用于細胞壁，空穴作用產生的效果使液體微粒間發生猛烈的撞擊作用，從而達到破壞細胞壁，加速細胞內容物溶解，使有效物質擴散后進行提取的目的，用以縮短提取時間和提高提取效率。

超聲波輔助法是通過物理因素破壞細胞壁，因此其不對所提取物的結構、活性產生影響，且不受成分極性和分子量大小的限制，適用于絕大多數有效成分的提取，又因為其具有操作簡單易行且提取料液雜質少，有效成分易于分離純化等優點，在各類有機化合物的提取中應用廣泛。

2.4 壓力輔助法

當前文獻中，有關竹蓀多糖壓力輔助提取的研究并不多見，更缺少該法下所得多糖的抗氧化活性的報道。王榮坤等通過壓力輔助提取法，發現粗多糖提取率低，而純度高達81.46%，純多糖提取率介于水提醇沉法和超聲波輔助法二者之間。在壓力輔助條件下，竹蓀多糖提取時間短、純度高，對于多糖類物質的提取研究有所幫助。

2.5 微波輔助法

微波輔助提取法是指使用適當的溶劑在微波反應器中，使用頻率在300 MHz至300 GHz的電磁波，利用電磁場的作用從樣品中提取各種化學成分的技術。微波輔助提取是通過高頻電磁波穿透萃取介質到達樣品內部，使其吸收微波攜帶的能量或由于激發和瞬時極化釋放的能量，導致細胞內部溫度迅速上升，使細胞破裂，有效成分擴散至提取介質中，便于之后分離純化。

微波輔助法具有加熱迅速、節能高效、控制簡便、環境友好、安全可靠等顯著優點，并能夠較好地完成存在于固體或半固體物質中的有機物提取，可有效使其與原有基體分離且保持原有結構等狀態，尤其在熱敏物質提取等方面具有特殊意義。

3 竹蓀多糖體外抗氧化性研究

近年來，抗氧化作用是真菌多糖的重要研究方向之一。相比于其他外源性抗氧化劑，真菌多糖所具有的毒性低、副作用小、來源廣等顯著優點備受研究者們青睞。現有研究表明，多種真菌多糖能夠清除自由基、提升抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化性活性，從而起到延緩衰老的作用。從國內研究結果得知，竹蓀多糖體外抗氧化性主要通過研究其對ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子等物質的清除能力來判定。

3.1 ABTS自由基清除活性作用

敢小雙等通過實驗發現，ABTS自由基會受到竹蓀多糖的抑制作用，當竹蓀多糖的濃度達到0.6 mg·mL時，ABTS自由基的清除率達到92.76%，抗氧化能力較好，故其可作為抗氧化劑進行儲備。

3.2 DPPH自由基清除活性作用

DPPH自由基是在517 nm附近有強吸收(顯深紫色)且溶于有機溶劑呈紫色的自由基。當與具有抗氧化性的樣品反應后，DPPH自由基的褪色程度與其被清除程度成定量關系，因此可通過分析其褪色程度來檢測樣品的抗氧化性強弱。其常用于定量測定藥品、食品和生物式樣的抗氧化能力。

王榮琨等通過研究不同提取方法的竹蓀多糖對DPPH自由基清除率的影響發現，超聲波輔助提取的多糖對于DPPH自由基的清除能力是最強的，在竹蓀粗多糖濃度為2 mg·mL時可以達到60.69%。敢小雙等研究濃度對DPPH自由基清除率的影響時證明，隨著質量濃度的增加，竹蓀多糖對DPPH自由基的清除率逐漸增大，且當竹蓀多糖濃度為25 mg·mL時，對DPPH自由基的清除率達到70.55%。林陳強等在實驗中分別用水、乙醇和乙酸乙酯等溶劑對棘托竹蓀菌蓋破碎物進行浸泡提取，發現其中醇提物清除DPPH自由基的能力最強。韓樂等通過研究表明，棘托竹蓀發酵菌絲體和發酵液的醇提物抗氧化活性均較好，并且其中菌絲體20%醇提物的抗氧化性最強，清除DPPH自由基的IC為0.012 mg·mL。

3.3 超氧陰離子基清除作用

鞏貴麗等通過實驗發現，不同濃度酶提所得的菌裙（柄）多糖對超氧陰離子有不同的清除能力：當多糖濃度從0.4 mg·mL增加到2.0 mg·mL時，各多糖對超氧陰離子的清除率逐漸增加，且增幅逐漸趨于緩和。當各種多糖濃度為2.0 mg·mL時，DIPs2對超氧陰離子基的清除率達到最高33.41%，其余依次為DIPs1(31.76%)、DIPs4(29.23%)及DIPs3(27.72%)。相比發現，各多糖均表現出較低的超氧陰離子清除水平。

綜上所述，竹蓀多糖對于以上自由基均表現出了較好的清除作用和還原作用，可見對竹蓀多糖還原功能的探索還具有極大的空間。

4 展望

竹蓀在我國有著豐富的資源和悠久的歷史，其作為一種珍貴的食用菌，在食用、藥用、工業等方面均有廣泛的利用價值和全方位開發應用前景，尤其在保健食品和中醫藥領域存在良好的應用潛力。然而，我們看到竹蓀多糖在綜合利用方面還存在一些問題。竹蓀菌體價格較為昂貴，致使其研究和產業化成本較高，但科學研究大部分僅僅使用菌蓋或者子實體部分，而同樣含有多糖類物質的菌托、菌柄則被視作廢棄物遺棄，造成大量自然資源浪費。下一步有關竹蓀多糖的科學研究應集中在綜合利用竹蓀，提高產品附加值和探索改良提取竹蓀多糖相關工藝，提高產率，降低成本等方面，使竹蓀多糖相關研究真正應用于人民生活。