國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“食品風(fēng)險(xiǎn)組分毒理學(xué)通路鑒別確證技術(shù)研究(2017YFC1601702)”進(jìn)展

針對(duì)用傳統(tǒng)的毒理學(xué)方法進(jìn)行毒性物質(zhì)職業(yè)健康安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估存在耗時(shí)費(fèi)力和食品風(fēng)險(xiǎn)組分毒性預(yù)測(cè)困難的問(wèn)題，本研究開(kāi)展食品風(fēng)險(xiǎn)組分毒理學(xué)通路鑒別確證技術(shù)方面的研究。

1 研究目的

使用遺傳通路對(duì)新型潛在食品風(fēng)險(xiǎn)化合物的遺傳毒性進(jìn)行篩選和確證，為食品非法添加物對(duì)職業(yè)健康的危害預(yù)防提供信息和技術(shù)支撐。

2 研究方法

(1)構(gòu)效關(guān)系分析初篩。研究針對(duì)2010年國(guó)家衛(wèi)健委公布的食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品非法添加物品種名單(共6批)，共126種食品添加物。本次研究使用的工具為Toxtree(version2.6.13)，通過(guò)輸入各種受試物的原型編碼或化學(xué)結(jié)構(gòu)，以決策樹的形式，根據(jù)結(jié)構(gòu)警示對(duì)物質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行分類和預(yù)測(cè)。

(2)脫細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｔ撃Ｐ偷闹苽溥^(guò)程如下：

制片：從SD大鼠眼眶取約1.5ml靜脈血，制備脫細(xì)胞核DNA板。

染毒與漂洗：以細(xì)胞裂解液作為染毒緩沖液。按受試物溶液分為高、中、低3個(gè)劑量組，以高劑量組為基準(zhǔn)，以2倍倍比關(guān)系稀釋為中、低劑量組，將純水和相同細(xì)胞裂解液作為對(duì)照組。

解旋與電泳：在堿性電泳液避光解旋30min。調(diào)節(jié)電壓25V，電流300mA，在堿性電泳液電泳，室溫30min。

漂洗：用純水漂洗，清洗中和電泳液，洗去過(guò)多的鹽(2次，5min/次)。

染色：滴加Gelred熒光染料染色，彗星光學(xué)顯微鏡下觀察損傷，然后用專業(yè)軟件(CometA1.0)定量分析尾部DNA百分比。該模型與單純脫細(xì)胞彗星試驗(yàn)相比，采樣簡(jiǎn)便，省時(shí)省力。

(3)細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)。選用繁殖能力強(qiáng)的懸浮細(xì)胞YAC-1小鼠淋巴瘤細(xì)胞。具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

染毒：將離心后的細(xì)胞加入受試物，陰性對(duì)照組(二甲基亞砜終濃度<0.05%)，六孔板染毒，每個(gè)劑量、每個(gè)受試物3個(gè)平行對(duì)照，共同放入37℃、5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱3h。

涂片：棄上清，收集細(xì)胞沉淀與70μl上樣膠涂在彗星載玻片上，作為一個(gè)樣本。

裂解：將載玻片浸沒(méi)于細(xì)胞裂解液，4℃下避光裂解1.5h(裂解液提前30min放入4℃冰箱，去除細(xì)胞膜與核膜，做成細(xì)胞核DNA板)。

漂洗：從裂解液中取出載玻片，在純水中洗去過(guò)多的鹽(2次，5min/次)。

解旋與電泳：在堿性電泳液避光解旋30min。調(diào)節(jié)電壓25V，電流300mA，在堿性電泳液電泳，室溫30min。

漂洗：用純水清洗中和電泳液，在純水中洗去過(guò)多的鹽(2次，5min/次)。

染色：滴加Gelred熒光染料，彗星光學(xué)顯微鏡下觀察損傷，用專業(yè)軟件(CometA1.0)定量分析尾部DNA百分比。

(4)哺乳動(dòng)物體內(nèi)彗星聯(lián)合微核實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物染毒、取材及過(guò)程如下：購(gòu)買的動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境3天，適應(yīng)期進(jìn)行檢疫和觀察，期間自由飲水和攝食。受試物用水或食用油作為媒介，溶解或懸浮于媒介中，受試物以灌胃方式給與，大鼠灌胃體積不超過(guò)10ml/kg體重，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半。陰性對(duì)照組為水或食用油，陽(yáng)性對(duì)照組為40mg/kg bw環(huán)磷酰胺(CP)，食品非法添加物L(fēng)D的1/4作為高劑量，中、低劑量組按2倍倍比關(guān)系稀釋。2次給受試物間隔24h，第2次給受試物6h后，對(duì)動(dòng)物腹腔注射麻醉，采外周血、分離肝細(xì)胞、分離骨髓細(xì)胞開(kāi)展堿性和中性彗星實(shí)驗(yàn)，同時(shí)骨髓細(xì)胞開(kāi)展微核試驗(yàn)。

3 研究成果

(1)確立DNA損傷篩選模型：脫細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)篩選模型、細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)篩選模型、哺乳動(dòng)物體內(nèi)彗星聯(lián)合微核實(shí)驗(yàn)確證模型。

(2)食品非法添加物中遺傳毒性物質(zhì)的篩選：完成126種非法食品添加物的篩選，篩選出11種可疑遺傳毒性物質(zhì)(乙醇、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、三聚氰胺、黃原膠、誘惑紅、酸性橙(橙黃Ⅱ)、堿性橙、甲醛次硫酸氫鈉二水合物)。

(3)靶器官遺傳毒性聯(lián)合確證：采用哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星、中性彗星及微核實(shí)驗(yàn)對(duì)以上11種可疑遺傳毒性物質(zhì)短期染毒未發(fā)現(xiàn)遺傳毒性；乙醇在一定劑量范圍內(nèi)致骨髓細(xì)胞DNA單鏈斷裂的劑量—反應(yīng)曲線呈現(xiàn)倒置的“U”字形。骨髓可作為乙醇的靶器官并可產(chǎn)生遺傳毒性。

4 經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益

(1)對(duì)學(xué)科/行業(yè)產(chǎn)生重要影響。建立的DNA損傷快速篩選，可以實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的快速篩選和確證，完善了遺傳毒理學(xué)的方法體系，為職業(yè)健康提供重要支持。利用本模型通過(guò)初步篩選已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的126種非法食品添加物中可能具有遺傳毒性的種物質(zhì)。為后續(xù)開(kāi)展針對(duì)這些物質(zhì)的職業(yè)健康安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)，同時(shí)有助于提高食品安全水平。

(2)對(duì)社會(huì)民生、生態(tài)環(huán)境、國(guó)家安全等產(chǎn)生積極作用。本課題建立的DNA損傷篩選和確證體系具有靈敏度高、實(shí)驗(yàn)周期短、檢測(cè)成本低、對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件要求低的特點(diǎn)。從遺傳毒性通路為食品非法添加物的監(jiān)管、檢測(cè)和危害預(yù)防提供技術(shù)支撐，有助于避免食品安全事件的發(fā)生，保障國(guó)民生命健康，減輕職業(yè)人群的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和健康安全風(fēng)險(xiǎn)。

(3)人才、專利、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)戰(zhàn)略在項(xiàng)目實(shí)施中取得初步成果。項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)重視人才培養(yǎng),積極實(shí)施專利技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)戰(zhàn)略。本年度多名博士生、碩士生正在培養(yǎng)中，豐碩的人才培養(yǎng)成果為推動(dòng)食品真實(shí)性鑒別領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展提供人才支撐。已培養(yǎng)和在培養(yǎng)學(xué)生3名；發(fā)表論文2篇；獲食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)1項(xiàng)。