馬鈴薯間作玉米對土壤細菌群落的影響研究

李光文，李 倩，崔慧珍，伏云珍，馬 琨

（1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學西北土地退化與生態恢復國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川 750021）

間作是一種有效的土地利用方式，被廣泛應用于農業生產中[1]。它能通過作物種內、種間的競爭與互利關系，促進田間植物群落多樣化，在實際生產中往往比單作更易獲取光、水和養分資源[2-3]。間作下土壤微生物能通過參與碳、氮循環來影響農業生產系統的可持續性，通過改變土壤養分有效性來影響植物的生長[4]。因此，植物、土壤和微生物之間的相互作用被認為是農業生態系統的主要驅動力[5]。

目前，有關間、套作對土壤微生物影響的研究多集中在豆類、禾谷類作物之間。Bossio等研究認為，土壤細菌群落的多樣性在作物生長和產量形成中具有重要作用[6]。研究證實，豆類-禾谷類間作、燕麥-紫云英間作可改變土壤細菌群落結構，提高細菌群落多樣性[7-8]；影響土壤革蘭氏陽性菌（G+）與革蘭氏陰性菌（G-）的比值[9]；增加土壤短芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬和喜鹽芽孢桿菌屬等有益菌屬所占比例，降低鏈球菌屬、奈瑟菌屬、梭菌屬和支原體屬等潛在致病菌屬的比例[10]。Zhang等[11]發現，玉米間作蠶豆明顯改變了土壤細菌群落結構，但沒有影響土壤細菌的多樣性。Taschen等[12]發現，小麥間作豌豆誘導的作物種間協同作用能通過減少土壤α-變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）的表達，增加放線菌門（Actinobacteria）的表達，改變土壤細菌的群落結構，并認為，土壤細菌群落結構和多樣性變化是由單作或間作根際分泌物的數量、性質所驅動[12]。也有研究指出，玉米間作馬鈴薯[13-14]、馬鈴薯間作蠶豆和馬鈴薯間作蕎麥[15]也會影響土壤細菌的分布，引起土壤細菌群落組成的變化，在一定程度上能夠提高細菌多樣性，改變土壤微生物的群落結構。土壤微生物對間作作物根系分泌物的選擇作用，是導致土壤微生物群落結構存在差異的主要原因[16-17]。可見，間作作物種類及種間關系差異會導致不同的研究結果。

間、套作對土壤細菌群落影響的研究雖然已有許多報道[7-8，10，12-17]，但由于土壤類型、作物種類、種間關系等差異，有關馬鈴薯間作玉米對土壤細菌群落多樣性的影響仍然缺乏[9-10]。本研究以連續4年馬鈴薯、玉米單作及間作的農田土壤為對象，利用TRFLP和磷脂脂肪酸的方法，分析持續馬鈴薯、玉米單作及間作下的土壤細菌群落組成、多樣性以及土壤主要微生物群落組成的變化規律，以期為合理間、套作栽培及作物選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于寧夏隆德縣沙塘鎮和平村，（106°0′37″E，35°35′11″N），海拔1 883 m，年均降水量502 mm，年均蒸發量1 370 mm。土壤類型為黑壚土，成土母質為黃土。供試土壤基礎理化性狀為：全氮1.65 g/kg，全磷1.35 g/kg，有機質33.28 g/kg，堿解氮70.00 mg/kg，速效磷49.24 mg/kg，速效鉀380.00 mg/kg，pH值為8.37（水土比5∶1）。

1.2 試驗設計

試驗開始于2014年4月，前茬作物為馬鈴薯。2014—2017年，采用單因素隨機區組設計，利用田間定位栽培，設3個處理，4次重復：馬鈴薯單作（P）、玉米單作（M）和馬鈴薯間作玉米（M||P），小區面積為4 m×4 m=16 m2。每小區種4幅，幅寬為1 m，玉米采用寬窄行覆膜種植，寬行60 cm、窄行40 cm、株距35 cm，每幅種3行。間作馬鈴薯采用平作種植，行距50 cm、株距40 cm，馬鈴薯與玉米間的行距為25 cm。間作下的馬鈴薯、玉米各種2幅，條帶比為2∶3。單作馬鈴薯每小區種4幅，每幅種兩行，行距50 cm、株距40 cm。供試玉米品種為長城706，馬鈴薯為青薯9號。基施尿素98.44 kg/hm2，磷酸氫二銨325 kg/hm2，全生育期不再追肥。

1.3 樣品采集及處理

2015年和2017年，均采用5點取樣法，在作物收獲前采集作物行間0~20 cm土層土壤樣品，間作處理采集馬鈴薯與玉米相鄰行間的土壤。本試驗共采集12個土壤樣本，各樣本獨立，低溫保存帶回實驗室后過1 mm篩，將過篩后的土壤樣本各分為2份，一份保存在-40℃冰箱，用于土壤微生物群落結構分析；一份保存在-80℃冰箱，用于土壤樣品的長期保存。2017年的一部分土壤樣本用于土壤細菌群落多樣性分析；一部分土樣自然風干，用于土壤理化性狀分析。

1.4 測試項目與方法

1.4.1 土壤理化性質的測定 土壤全氮（TN）采用半微量凱氏法；有機質（OM）采用重鉻酸鉀氧化外加熱法；全磷采用HClO4-H2SO4消煮，鉬銻抗比色法；堿解氮采用堿解擴散法；速效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法；土壤pH采用酸度計測定，（水土比5∶1）[18]。

1.4.2 土壤細菌群落組成及多樣性測定 土壤微生物脂肪酸的測定采用PLFAs分析，通過Agilent 7860型氣相色譜儀，MIDI Sherlock脂肪酸圖譜微生物鑒定系統分析待測樣品[19]。樣品提取主要通過前提黑暗培養、濃縮、固相萃取、酯化等過程。

土壤細菌群落結構及多樣性采用T-RFLP的方法。土壤總DNA提取采用OMEGA公司的試劑盒，按照操作說明進行。細菌通用引物序列為：前引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），后引物926R（5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′）。擴增產物經SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收，分別用HaeⅢ和MspⅠ兩種限制性內切酶（上海生工）進行酶切，擴增體系、程序以及酶切體系參見秦越等的研究方法[20]。熒光標記（FAM）引物由上海生工合成，擴增所用的Taq Plus DNA聚合酶為天根生化科技有限公司生產，酶切產物低溫避光委托上海生工經毛細管電泳分離，在ABI自動測序分析儀上記錄樣品片段信息，比較細菌群落差異。

采用香農-維納（Shannon-Weiner）指數（H）和均勻度指數（E）描述土壤細菌群落結構多樣性，計算公式參見Dunbar J的方法[21]。

H0=-∑pi lnpi，其中，pi為限制性內切酶酶切的特定長度末端片段相對峰面積（i峰的峰面積/所有峰面積的總和）；群落的均勻度E=H/Hmax，其中Hmax=log2（S）表示對應群落中所有分類群都同樣豐富時的群落多樣性。

1.5 數據處理

選擇熒光強度大于50個相對熒光單位（RFU）且長度在50～500 bp之間的末端片段（T-RFs）作為有效片段進行后期數據處理[22]；采用Biodap軟件計算土壤細菌群落的Shannon-Weiner指數及Evenness指數。為減少實驗誤差，T-RFLP方法測定的數據均為HaeⅢ和MspⅠ兩種內切酶的均值；DPS 7.05軟件進行單因素方差分析的LSD法多重比較（P＜0.05），Canoco 5.0軟件進行RDA分析。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯玉米單作及間作栽培對土壤細菌群落的影響

由圖1可見，2015年收獲期，持續馬鈴薯單作、玉米單作及間作栽培下土壤細菌、G+和G-脂肪酸含量無顯著差異，而馬鈴薯單作的G+/G-比值與玉米單作及間作栽培間差異顯著（P＜0.05）。2017年收獲期，除對應土壤G-脂肪酸含量在玉米單作和馬鈴薯單作間有顯著差異外（P＜0.05），土壤細菌、G+和G+/G-在不同處理間均無顯著差異。試驗中，隨單作及間作栽培時間的延長，2017年度，以PLFAs表征的土壤細菌、G+和G-生物量較2015年有一定幅度的下降。其中，玉米單作、馬鈴薯單作以及馬鈴薯間作玉米體系下土壤細菌的脂肪酸含量分別降低了20.14%、39.02%和42.53%；土壤G+的脂肪酸含量分別下降了24.90%、21.60%和32.47%；土壤G-的脂肪酸含量分別下降了16.99%、46.82%和47.14%。2017年較2015年相比，除馬鈴薯單作的土壤細菌和G-外，其他處理的土壤細菌和G-脂肪酸含量均有顯著差異（P＜0.05），且G-在間作栽培的年度間有極顯著差異（P＜0.01)。除間作栽培下G+和G+/G-有顯著差異外（P＜0.05），其他處理的年度間G+和G+/G-均無顯著差異。

圖1 馬鈴薯、玉米單作及間作栽培對土壤細菌群落的影響

總體上，在同一年內，各處理的土壤細菌脂肪酸含量波動幅度很小，但年際間，馬鈴薯間作玉米栽培模式下的土壤細菌、G-和G+的脂肪酸含量以及G+/G-比值均有顯著性差異，以PLFAs表征的G-生物量變化對栽培模式和時間的長短比G+更敏感，年際間的差異較年度內的變化更明顯。

2.2 間作栽培對土壤細菌群落多樣性的影響

由圖2可見，與單作馬鈴薯、單作玉米相比，連續馬鈴薯玉米間作4年后，土壤細菌群落的香農-維納指數和均勻度指數分別提高了6.25%～8.97%和2%。但馬鈴薯間作玉米及單作栽培模式下的土壤細菌群落多樣性及均勻度指數間均無顯著差異。可見，連續馬鈴薯、玉米單作及間作在短期內并沒有改變土壤細菌群落的多樣性。

圖2 馬鈴薯、玉米單作及間作栽培對土壤細菌多樣性的影響

2.3 馬鈴薯玉米間作及單作栽培對細菌菌群結構組成的影響

試驗中將T-RFs末端片段與細菌16S rRNA核糖體數據庫進行比對，結果表明，馬鈴薯單作、玉米單作及間作下所鑒定出的土壤細菌分屬20門，其中單作玉米土壤細菌分屬14門，單作馬鈴薯土壤細菌分屬16個門，馬鈴薯間作玉米細菌分屬17門。相對豐度百分比較高的前10門細菌，土壤細菌厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為不同栽培模式下的土壤細菌優勢菌門（圖3），且不同處理間均無顯著差異。連續玉米單作下，對應土壤厚壁菌門的相對豐度百分比達到37.3%，較馬鈴薯單作和馬鈴薯間作玉米分別高出22.69%和34.17%；土壤變形菌門的相對豐度百分比較單作馬鈴薯、馬鈴薯間作玉米也分別高出19.25%和7.63%；擬桿菌門的相對豐度則分別高出27.16%和40.4%。然而，整個土壤細菌群落中，相對豐度百分比較低的柔膜菌門（Tenericutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）卻表現為馬鈴薯間作玉米均高于單作處理，但各處理間均無顯著差異。可見，不同栽培模式下，土壤細菌群落組成在門水平的相對豐度百分比上存在差異，持續馬鈴薯間作玉米降低了土壤中厚壁菌門細菌的相對豐度百分比，影響了土壤細菌門水平上的群落組成。

圖3 馬鈴薯、玉米間作栽培影響下的土壤細菌門水平分類學組成及分布

2.4 馬鈴薯間作玉米對土壤細菌功能菌群的影響

由表1可見，間作模式下參與土壤氮循環、碳循環、纖維素降解以及硫循環過程的T-RFs所對應功能菌屬的豐度百分數，整體高于玉米單作和馬鈴薯單作處理所對應的土壤。長度為89、159、150 bp的T-RFs片段，歸屬為土壤亞硝化單胞菌屬、節桿菌屬和固氮螺絲菌屬，均與土壤氮循環有關，為馬鈴薯間作玉米模式下所特有；不同處理下，長度為125、128 bp的T-RFs片段所對應的中慢生根瘤菌屬細菌相對豐度百分比也以馬鈴薯間作玉米栽培模式最高。與土壤碳循環有關的T-RFs片段分別為125、141、142、159、160、169、195、200、203 bp，其對應的土壤細菌優勢菌群歸類為鏈霉菌屬，其豐度百分比較玉米單作、馬鈴薯單作分別高出2.78倍、1.84倍。此外，參與碳循環，并且歸屬為醋桿菌屬130 bp的TRFs片段和擬桿菌屬93、95、171 bp的T-RFs片段的細菌相對豐度百分比也以間作處理較高。

表1 土壤細菌T-RFs對應的功能菌群相對豐度百分比

間作模式下，T-RFs片段長度為200、364、397、402 bp的根瘤菌屬相對豐度百分比較單作玉米高出了1.87%，是單作馬鈴薯的2.06倍；中慢生根瘤菌屬的豐度百分比為單作玉米的25.33倍，高出單作馬鈴薯2.28%。間作處理中有益菌屬的喜鹽芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬豐度百分比較單作玉米、單作馬鈴薯也有顯著增加。馬鈴薯間作玉米下土壤潛在致病菌的梭菌屬、支原體屬、鏈球菌屬的豐富百分比均低于單作玉米和單作馬鈴薯；其相對豐度百分比僅相當于對應微生物菌屬的5.68%~10.61%、18.18%~42.42%、18.34%~50.21%；奈瑟菌屬僅出現在單作玉米處理。

可見，間作能通過影響與碳、氮、硫循環有關的土壤細菌群落豐度百分比而影響細菌群落的組成。間作在一定程度上降低了潛在致病菌所占比例。

2.5 馬鈴薯間作玉米下土壤細菌群落組成與土壤理化性狀間的相互關系

RDA分析表明（圖4），全部排序軸能夠在累積變量74.24%上揭示單作及間作體系對土壤細菌門水平分類學組成差異的影響，其中第一排序軸解釋變量為56.81%，第二排序軸解釋變量為17.43%。厚壁菌門相對豐度的改變與土壤全氮呈正相關，而變形菌門、棲熱菌門、擬桿菌門、疣微菌門相對豐度的改變與土壤有機質和速效鉀呈正相關，放線菌門相對豐度的改變與土壤全氮、全磷呈正相關，與土壤有機質和速效鉀呈負相關。但蒙特卡羅檢驗表明，馬鈴薯單作、玉米單作及馬鈴薯間作玉米栽培4年后的土壤各理化性狀指標與土壤細菌群落組成相對豐度間的相關性均不顯著（P>0.05)。本試驗條件下，土壤理化性質的差異并不是驅動土壤細菌群落組成中各主要微生物類群相對豐度差異的主要原因。

3 討論

3.1 間作栽培對土壤細菌主要類群生物量的影響

試驗中，馬鈴薯間作玉米下土壤細菌PLFAs與同一年限馬鈴薯單作、玉米單作均沒有差異，這與Li[23]對玉米間作花生的研究結論一致。在相同栽培年限下，以PLFAs表征的G+生物量在馬鈴薯單作、玉米單作及馬鈴薯間作玉米間無顯著差異，但G-的脂肪酸含量在單作玉米與單作馬鈴薯間有顯著性差異。Esperschütz等[24]、Buyer等[25]研究表明，相對G+，G-對共生營養條件較敏感，往往更加依賴根系分泌的碳化合物，能主導枯落物碳的同化[26]。分析認為，玉米根系與馬鈴薯根系的分泌物都能為G-提供更豐富的可利用碳源，但單作玉米地上部生物量遠大于單作馬鈴薯，這可能有助于更多的玉米枯落物進入土壤；由于G-優先利用輸入土壤系統的新鮮植物枯落物和根系分泌的低分子量有機碳化合物，而G+被認為偏好于較老的以及經微生物轉化的土壤有機質為碳源[27-28]。因此，這可能就是馬鈴薯單作與玉米單作間，以PLFAs表征的G-生物量有顯著差異的主要原因。

試驗中，相比2015年，2017年各處理下以PLFAs表征的細菌、G+和G-生物量呈現下降趨勢，且間作栽培下降最為顯著，G-較G+脂肪酸含量在年際間的差異較年度內的變化更明顯；G+/G-比值除單作玉米外，其他處理在年際間有上升的趨勢，且馬鈴薯間作玉米顯著上升。楊敏等[29]發現，魔芋連作會使根際土壤中細菌數量明顯增多，這與本試驗結果相反；而劉瑩瑩等[30]在黃瓜連作中發現，隨著栽培年限的增加，土壤細菌、G-細菌PLFAs量呈降低趨勢，這與本試驗結果一致。可見，隨著栽培年限增加，不同作物對土壤細菌、G+和G-生物量的影響不同，而間作栽培由兩種作物共同參與，更有益于土壤細菌、G+和G-生物量的調節。土壤中G+/G-比值能反應農田生態系統的穩定性，G+/G-比值越大，土壤生態系統越穩定[31]；G+/G-比值的高低也能表明腐殖化碳源的多少[32]。可見，相比2015年，2017年馬鈴薯間作玉米的G+/G-比值顯著上升的主要原因是馬鈴薯間作玉米栽培更有利于土壤生態系統的穩定，并能腐殖化更高的碳源。

3.2 間作栽培對土壤細菌群落組成、多樣性及功能的影響

單作馬鈴薯、單作玉米及馬鈴薯間作玉米下土壤厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為土壤細菌優勢菌門；馬鈴薯間作玉米表現出較高的相對豐度，這與Zheng等[33]的研究結果一致。相關研究認為，間作作物類型不同，改變了菌門相對豐度的百分比，卻未改變優勢菌門的類型，這可能是處于相同生長環境中的土壤微生物類群具有相似性[34]。趙雅效等[35]在紫花苜蓿間作小黑麥中發現土壤細菌的優勢菌門是變形菌門和擬桿菌門，并發現間作能改變土壤變形菌門和擬桿菌門的相對豐度，提高土壤細菌豐富度和多樣性，這與Zhang等[36]桑樹間作紫花苜蓿的研究結果一致。同時，變形菌門在土壤細菌群落中具有較高的相對豐度[37]，并且是堿性土壤的優勢種群[38-39]。本試驗中，厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門相對豐度的改變，可能是種植模式和作物不同導致的[40]，其改變了土壤根際微環境，改善了細菌菌門多樣性，使相對豐度發生了變化。也可能受土壤類型的影響[41]，存在對土壤微環境敏感性強的細菌，能刺激特定菌門細菌的生長，并成為優勢菌門，具體原因有待進一步研究。

本研究表明，與單作相比，馬鈴薯間作玉米下土壤細菌群落的多樣性和均勻度指數間無差異。這同樊曉剛等[42]土壤微生物群落通常具有比較穩定的多樣性特征的研究結論一致。但Li等[23]、Latati等[43]研究認為，間作作物地下交互作用導致根際土壤微生物群落的物種組成具有特異性。實際上，在間作條件下，植物根系不是完全孤立而是相互交織在一起，通過作物根系活動、分泌物、根際沉積特征的影響以及豆科作物根際土壤特異性細菌，刺激作物根際的過程，導致根際化學特性的變化，是間作下土壤細菌多樣性產生明顯差異的主要原因。然而，試驗中，馬鈴薯間作玉米下土壤微生物群落多樣性與前人研究結果的差異表明，間作體系對土壤微生物群落的調控是一個緩慢的過程，在多種因子綜合作用下，隨種植年限延長，間作與單作對土壤微生物多樣性的影響差異，才有可能逐漸表現出來。

試驗中，間作下參與碳循環的擬桿菌屬細菌相對豐度顯著增加，相關研究也證實，土壤厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門細菌與土壤碳的降解有關[44]。因此，這也間接說明土壤擬桿菌屬細菌是重要的有機物分解者。間作模式下，馬鈴薯、玉米地下種間作用可能有利于提升土壤細菌的分解能力。有研究證實，細菌群落結構的變化顯著影響了由專性微生物介導的固氮和硝化作用等功能過程[45]。Song等[46]的研究結果表明：禾谷類作物和豆科作物間作，能改變固氮菌的優勢種，影響土壤微生物的群落組成，進而促進豆類作物結瘤固氮。玉米花生間作，較單作顯著增加了與固氮有關的土壤細菌的相對豐度，是因為玉米花生間作減少了與反硝化作用有關的基因拷貝數，顯著緩解了化學氮肥對結瘤和N2固定的抑制效應[17]。本研究中，脫硫弧菌屬相對豐度的顯著增加，也表明馬鈴薯間作玉米能促進土壤硫循環，改善土壤理化性質以及土壤硫元素的有效性，這同Muyzer和Stams[47]有關脫硫桿菌屬（Desulfobacterium）的描述類似。總體上，馬鈴薯間作玉米增加了與土壤碳、氮、硫循環以及纖維素分解有關細菌菌屬的相對豐度。增加了有益菌，降低了有害菌的豐度。但在禾本科（玉米）與茄科作物（馬鈴薯）的種間作用下為什么能產生與禾本科、豆科間作類似的微生物功能效應，還需要進一步研究。

試驗中，土壤厚壁菌門相對豐度與全氮呈正相關，土壤變形菌門、擬桿菌門相對豐度與土壤速效鉀、有機質呈正相關。這是因為厚壁菌門、擬桿菌門細菌能參與土壤養分的循環，對土壤全氮、速效鉀和有機質具有一定的消解作用，使其快速轉變為作物生長所需的營養物質[48]。此外，厚壁菌門是在作物根際土壤中存在的一種固氮菌，能很好地參與土壤氮素的轉化[49]。變形菌門屬于異養型細菌，是與植物共生的固氮細菌，能增強土壤的固氮能力，其豐富度的高低能在一定程度上反應土壤有機質含量的高低[34]。擬桿菌門是有機碳的主要礦化者[50]，能為土壤細菌的活動提供一定的碳源，這與本研究中變形菌門、擬桿菌門與有機質呈正相關的結論相吻合。因此，土壤全氮、速效鉀和有機質含量能影響相應菌門相對豐度的變化。但本研究中，RDA檢驗表明，土壤各理化性狀指標與土壤細菌群落組成相對豐度間的相關性不顯著，故土壤理化差異不是驅動土壤細菌群落組成變化的主要原因。可見，驅動間作土壤細菌變化是土壤環境整體變化的結果，它可能由種植模式、作物種類、氣候因子、土壤環境因子以及作物間的種競爭互利關系等因素共同決定。

4 結論

馬鈴薯玉米間作及單作栽培在短期內沒有影響土壤細菌群落的多樣性，但改變了土壤細菌群落組成，不同栽培模式下的土壤細菌群落相對豐度差異沒有受到土壤理化性質差異的顯著影響。玉米單作下土壤革蘭氏陰性菌（G-）對土壤環境變化的影響比馬鈴薯單作和馬鈴薯間作玉米對土壤的影響更敏感。馬鈴薯間作玉米提高了土壤中有益細菌菌屬的豐度百分比、降低了潛在致病菌屬的豐度百分比。