硒對鉛中毒誘導蛋雞腎臟炎癥損傷緩解作用研究

趙 騫，劉桐序，李 琦，秦 雪，黃 賀

（東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱150030）

鉛（Pb）是一種有毒物質，不僅導致飼料、食品、水土污染，也損害人類神經系統、心血管系統以及生殖系統[1-2]。鉛過量可誘發人和動物炎癥并損害腎臟[3]。炎癥產生與白細胞介素-6（IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）和環氧化酶-2（COX-2）有關[4]。NF-κB可介導炎癥反應且調控TNF-α和COX-2等表達[5]；NF-κB、TNF-α和COX-2均參與鉛誘導的肝臟炎癥[6]。氧化應激與雞法氏囊和腸道損傷有關[7]，鉛可通過改變谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）誘導氧化應激。雞血清中肌酐（CREA）和尿酸（UA）含量是檢測機體腎功能的指標，當腎臟發生損傷時，腎功能減退，引起CREA和UA含量升高[8]，可通過檢測兩者濃度判斷鉛對腎功能的損傷。

硒（Se）是一種具有抗氧化和抗炎特性的微量元素[9]，可減輕鉛處理后雞只氧化應激反應[10]、細胞因子[7]和炎癥損傷[11]。楊凱研究發現硒改善鉛誘導雞免疫器官中T-AOC、GPx、GST、SOD和CAT活力及GSH、MDA和H2O2含量[12]；王克鑫研究表明硒緩解鉛對雞腎臟毒性[13]；Xu等研究表明長期暴露于硒和鉛會影響雞肝中離子分布，硒對鉛的緩解作用可能與雞肝中離子譜變化有關[14]。

目前關于鉛中毒對機體損傷研究較多，且大多集中于人類與嚙齒動物。腎臟是鉛中毒重要靶器官之一，但硒對鉛誘發腎臟炎癥的緩解作用尚未完全了解，需進一步研究。因此，文章以雞為研究對象，設計鉛硒互作模型，通過檢測鉛硒濃度、腎臟功能、氧化應激指標和炎癥相關因子，繼續探討炎癥機制及硒對鉛引起的雞腎臟炎癥緩解作用，為鉛對腎臟的毒性研究和硒對鉛引起的腎臟炎癥緩解提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組與管理

于哈爾濱先鋒孵化場購買80只1日齡海蘭白蛋雞，飼喂一周標準日糧和飲水后，選擇體重相近72只健康小雞隨機平均分配到對照組、鉛組、硒組和鉛硒組中，各組日糧和飲水分別為：對照組采用標準日糧，標準飲水；鉛組采用標準日糧，加鉛飲水（350 mg·L-1鉛）；硒組采用加硒日糧（1 mg·kg-1硒），標準飲水；鉛硒組采用加硒日糧（1 mg·kg-1硒），加鉛飲水（350 mg·L-1鉛）。日糧和飲水中通過添加Na2SeO3和（CH3OO）2Pb達到設定濃度。蛋雞在正式試驗過程中單籠飼養，自由采食和飲水。分別在試驗第4、8和12周后，心臟取血后置于EP管中用于檢測腎功能指標。然后對蛋雞進行安樂死，置于冰盤上解剖，采集腎臟組織，用于試劑盒檢測和mRNA表達、蛋白質表達檢測。

1.2 腎臟中硒和鉛濃度檢測

每個腎臟樣品（約1 g）和空白對照分別于80℃下消化4 h后用純水將溶液定容至10 mL，溶液分別在100℃、150℃和180℃加熱3、10和45 min。用純水將獲得的樣品體積定容至10 mL，電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS；Thermo iCAPQ，USA）測定樣品中鉛和硒濃度。

1.3 腎功能指標檢測

將采集血液樣品靜置30 min后以4 000 r·min-1離心10 min取上清液，使用自動化診斷分析儀按照試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）說明檢測雞血清中肌酐（CREA）（Kit number：C011-2）和尿酸（UA）（Kit number：C012-1）含量。

1.4 氧化應激指標檢測

將一部分腎臟組織樣本勻漿，用生理鹽水稀釋10倍，2 500 r·min-1離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明（購自南京建成生物工程研究所）測定MDA、GSH、GPx和SOD含量。

1.5 mRNA表達檢測

每個腎臟樣本取約0.1 g，加入1 mL TRIzol試劑（TaKaRa，Japan），用冷凍研磨儀反復研磨至樣本粉碎，提取腎臟組織總RNA。用分光光度計（保健生物科學公司，瑞典）測定RNA的OD260/OD280。使用試劑盒（PrimeScriPt?RT，日本），在60 μL反應體系中將提取總mRNA合成cDNA。β-actin作為內參基因，引物由上海Invitrogen公司合成，序列見表1。用試劑盒（羅氏公司，瑞士）在10 μL反應體系中作實時熒光定量PCR反應，用2-ΔΔCT方法計算mRNA相對表達量。

表1 實時定量PCR引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.6 蛋白質表達檢測

第12周用Western、IP細胞裂解緩沖液（Beyo?time，上海）和苯甲基磺酰氟（Beyotime，上海）提取雞腎臟總蛋白。蛋白濃度用BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo Scientific，美國）測定。總蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在含20%甲醇的三甘氨酸緩沖液中轉移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂牛奶在37℃用一級抗體孵育硝化纖維素膜2 h（cas?pase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2），4℃過夜保存，在磷酸緩沖鹽水中用吐溫20洗滌3次（每次15 min），用過氧化物酶結合物和辣根過氧化物酶結合物二級抗體孵育細胞膜。添加新制的BeyoECL Plus（Beyotime，Shanghai，上海），最后使用化學發光儀器（Amersham Imager 600 RGB，General Electric Company，美國）對膜進行成像。

1.7 數據統計分析

結果以平均數±標準差（n=6）表示，用R 3.6.2作統計分析。對硒和鉛濃度、肌酐和尿酸含量及caspase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2蛋白表達量作正態性和方差齊性檢驗，通過后用單因素方差分析，對存在顯著差異因素用Bonfferoni作多重比較分析。對氧化應激指標、細胞因子和炎癥相關基因mRNA表達量作正態性和方差齊性檢驗，通過后用雙因素方差分析，對存在顯著差異的因素用Bonfferoni法作多重比較；若未通過正態性和方差齊性檢驗，用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 血清中肌酐和尿酸含量及腎臟中硒和鉛濃度

為評估鉛和硒對腎功能的影響，在第12周時測定血清中肌酐和尿酸含量及腎臟中硒和鉛濃度，結果見圖1。

由圖1A和1B可知，肌酐和尿酸含量在對照組和硒組中差異不顯著（P>0.05）；鉛組和鉛硒組中肌酐含量顯著高于對照組和硒組（P<0.05），鉛組顯著高于鉛硒組（P<0.05）。由圖1C可知，硒濃度由高到低為硒組、對照組、鉛硒組和鉛組，組間差異顯著（P<0.05）。由圖1D可知，鉛濃度由高到低為鉛組、鉛硒組、對照組和硒組，組間差異顯著（P<0.05）。

圖1 血清中肌酐和尿酸含量及腎臟中硒和鉛濃度Fig.1 Se and Pb concentrations in chicken kidneys and CREA and UA contents in chicken serum

2.2 MDA、GSH含量及SOD、GPx活性

為評估鉛和硒對氧化應激的影響，在第4、8和12周時測定雞腎臟中MDA和GSH含量及SOD和GPx活性（見圖2）。除對照組和硒組之間MDA和GSH含量及SOD活性外，各組MDA（見圖2A）和GSH（見圖2B）含量及SOD（見圖2C）和GPx（見圖2D）活性在3個時間點上均差異顯著（P<0.05）。與對照組和硒組相比，鉛組和鉛硒組MDA含量顯著提高（P<0.05），其他3個指標顯著降低（P<0.05）。與鉛硒組相比，鉛組MDA含量顯著升高（P<0.05），其他3個因子顯著降低（P<0.05）；對照組GPx活性顯著低于硒組（P<0.05）。此外，MDA含量隨鉛處理時間增加呈顯著上升趨勢（P<0.05），其他指標均呈顯著下降趨勢（P<0.05）。

圖2 氧化應激指標Fig.2 Oxidative stress indicators

2.3 細胞因子mRNA表達

本試驗中，在3個時間點檢測雞腎臟中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ中mRNA表達水平（見圖3）。4種細胞因子中檢測結果在對照組和硒組間均無顯著差異（P>0.05）。與對照組相比，IL-1β（見圖3A）、IL-6（見圖3B）、IL-17（見圖3C）mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）；第8和12周時鉛硒組和鉛組IFN-γ的mRNA表達水平顯著低于對照組和硒組（P<0.05）。第4、8和12周，鉛組中IL-1β、IL-6、IL-17的mRNA表達隨鉛處理時間增加顯著升高（P<0.05），相反IFN-γ的mRNA表達顯著降低（P<0.05）。可看出IL-1β、IL-6、IL-17的mRNA表達隨鉛處理時間增加呈顯著升高趨勢（P<0.05），IFN-γ mRNA表達水平呈顯著下降趨勢（P<0.05）。

圖3 細胞因子mRNA表達Fig.3 mRNA expression of cytokines

2.4 炎癥因子mRNA和蛋白質表達

為確定鉛是否能引起炎癥損傷和硒對鉛毒性緩解作用，在第4、8和12周檢測caspase-1（見圖4A）、TNF-α（見圖4B）、NF-κB（見圖4C）、NLRP3（見圖4D）、COX-2（見圖4E）mRNA表達及上述因子在第12周蛋白質表達水平（見圖4F）。上述指標在對照組與硒組間差異不顯著（P>0.05）。與對照組和硒組相比，鉛組和鉛硒組中caspase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2中mRNA和 蛋 白 質 相對表達量顯著升高（P<0.05）。鉛組上述因子mRNA和蛋白質表達量也顯著高于鉛硒組（P<0.05），且mRNA表達量均隨鉛處理時間增加呈顯著升高趨勢（P<0.05）。

圖4 炎癥因子mRNA和蛋白表達Fig.4 mRNA and protein expression of inflammatory factors

3 討論

腎臟是鉛積累主要器官，過量鉛損害雞腎臟功能并引起炎癥。NLRP3激活有助于小鼠慢性促炎狀態發展[15]，研究發現炎癥參與鉛引起的小鼠腎臟損傷[16]。本研究中鉛處理后蛋雞腎臟中發現高濃度鉛，血清中肌酐和尿酸含量升高說明鉛發揮毒性并誘導雞腎臟發生炎癥損傷。此外，發現補充鉛增加蛋雞腎臟組織鉛濃度且降低硒濃度，進一步證明鉛在腎臟有積累效應。

NLRP3炎癥體是炎癥性疾病的廣泛特征之一。NLRP3炎癥小體中caspase-1的激活可誘導IL-1β和IL-18成熟，促進炎癥反應[17]。NLRP3、caspase-1和IL-1β在血紅素引起的小鼠腎臟炎癥中表達上調[18]；H2S暴露增加IL-1β的表達導致蛋雞胸肺炎癥損傷[19]。因此，研究NLRP3、caspase-1和IL-1β是否與鉛處理蛋雞腎臟炎癥損傷有關。在鉛處理蛋雞腎臟中，NLRP3、caspase-1和IL-1β表達上調并發生炎癥反應，表明NLRP3是通過觸發caspase-1和IL-1β介導鉛引起炎癥損傷。此外第12周鉛組NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA表達水平分別是對照組的10.45倍、13.05倍和4.90倍，因此推測NLRP3炎癥小體、caspase-1和IL-1β可能是鉛致蛋雞腎臟炎癥損傷的敏感因子。

NF-κB、TNF-α和COX-2在炎癥反應中起重要作用。研究表明，過量鉛增加NF-κB、TNF-α和COX-2中mRNA表達水平進而引起蛋雞腸道炎癥反應[20]。本研究中進一步研究發現，鉛處理蛋雞腎臟中NF-κB、TNF-α和COX-2 mRNA和蛋白質表達水平升高，IL-6、IL-17 mRNA表達水平升高、IFN-γmRNA表達水平下降并發生炎癥反應，進一步證實鉛對雞腎臟造成炎癥損傷。另外發現，在雞腎臟中NLRP3、caspase-1、細胞因子（包括IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ）和炎癥因子（包括NF-κB、COX-2和TNF-α）mRNA表達與染鉛毒時間有關。Sun等研究也認為NF-κB、TNF-α和COX-2的mRNA在淋巴細胞[21]和睪丸[22]中表達均具有時間效應。

有害物質（如鎘、硫化氫、氨）也可誘導氧化應激。GSH、SOD和GPx是抗氧化酶，能抵抗活性氧引起的副作用，相反MDA是氧化應激標志物，指示活性氧過度產生和細胞膜損傷。Chi等研究發現，鉛暴露導致雞肝臟氧化損傷，抑制GST和GPx等抗氧化酶活性同時增加MDA含量[23]；鉛通過降低雞睪丸中GSH、SOD和GPx導致氧化應激[24]。本文預測氧化應激與炎癥發生有關，并通過測定GSH和MDA含量及SOD和GPx活性驗證。本研究發現鉛處理后MDA含量升高，GSH含量、SOD和GPx活性降低且出現氧化應激反應。從上述發現推斷，鉛引起的氧化應激激活NLRP3進一步刺激炎癥反應引起雞腎臟損傷，與上述研究結果一致。另外，上述氧化應激指標變化也與鉛處理時間有關。

硒可減輕鉛對雞器官造成的損傷。研究發現鉛濃度、CREA和UA含量升高及硒濃度下降，表明硒減輕鉛引起腎臟炎癥損傷。硒具有拮抗鉛引起雞肝臟炎癥因子及熱休克蛋白表達增加的作用[25]；?zkan-Y?lmaz等研究發現，硒可改善鉛誘導鯉魚肝臟和腦組織氧化應激[26]；硒拮抗鉛引起尼羅羅非魚腎毒性，可改善鉛中毒尼羅羅非魚腎功能[27]，均與本文研究結果一致。但具體緩解作用機制尚不明確，可能是因硒與重金屬鉛形成硒-鉛復合物，緩解鉛毒性[28]。

考慮到硒抗氧化和抗炎特性，本文進一步研究硒是否緩解鉛誘導雞腎臟氧化應激和炎癥。硒處理使雞睪丸中GSH含量和SOD活性增加并緩解氧化應激[29]。硒通過降低脂多糖處理巨噬細胞中NF-κB、TNF-α和IL-6緩解炎癥[30]。本試驗中，硒緩解由鉛引起的MDA、NLRP3炎性小體、cas?pase-1、NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17增多及GSH、SOD、GPx、IFN-γ減少，與前人研究結果一致。從上述結果推斷，硒緩解雞腎臟中鉛引起的氧化應激和炎癥反應。

4 結論

硒緩解鉛處理過的雞腎臟炎癥損傷；NLRP3炎癥小體、caspase-1、TNF-α、NF-κB和COX-2參與硒緩解鉛誘導的雞腎臟氧化應激介導的炎癥損傷機制，其中NLRP3炎性小體、caspase-1和IL-1β可能是鉛致雞腎臟炎癥損傷敏感因子。