高效液相色譜法測定花椒中吡蟲啉的殘留量

杜 平，李浩浩

（眉縣食品安全檢驗檢測中心，陜西眉縣 722301）

吡蟲啉（分子式C9H10ClN5O2）是煙堿類超高效殺蟲劑，吡蟲啉可有效防治粉虱、葉蟬、蚜蟲、薊馬、負泥蟲、潛葉蠅等刺吸式口器害蟲。在花椒開花前和坐果后打藥防蟲效果最佳。目前吡蟲啉是花椒防蟲中使用最廣泛的殺蟲劑。近年來關于花椒中吡蟲啉殘留量超標事件，引起了人們的關注。2016 年臺灣地區檢出大陸出口花椒中吡蟲啉的殘留量0.14 mg/kg[1]。依據農藥殘留容許量標準，吡蟲啉的殘留量為0.05 mg/kg。韓國進口食品2020 年6 月12 日，韓國食品藥品安全部（MFDS）發表消息稱，韓國進口食品等進口、銷售企業大華MP（株）從中國上海進口、銷售的花椒中檢出吡蟲啉超標[2]?！端?、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留量的測定高效液相色譜法》（GB/T 23379—2009）對水果、蔬菜及茶葉中的吡蟲啉殘量的測定進行了規定，但缺少對花椒中吡蟲啉殘留量檢測的國家標準?；ń分羞料x啉殘留量檢測分析方法目前國內研究的較少[3-6]。本文旨在探究花椒中吡蟲啉殘留量檢測方法的有效性、準確性。經過筆者多次試驗、研究，探索出了具有可操作性強、檢測速度快、檢測結果精準的操作方法，彌補了對花椒中吡蟲啉殘留量的檢測方法的技術空缺。

1 材料和方法

1.1 儀器與設備

吡蟲啉標準品（濃度100 μg/mL，農業部環境保護科研檢測所）、乙腈（賽默飛）、甲醇（賽默飛）、二氯甲烷（天津賽孚瑞）、中性氧化鋁固相萃取柱（艾杰爾）、氨基固相萃取柱（艾杰爾）、C18固相萃取柱（艾杰爾），高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Umlit 3000）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱型號：BDS HYPERSIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：30%乙腈水溶液；紫外檢測器波長：270 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量，10 μL。

1.2.2 樣品前處理

（1）提取。將干花椒用高速均質機粉碎，準確稱取5.0 g樣品于100 mL 離心管中，加入10 mL 水浸泡5 min 后，依次加入5 g 氯化鈉，50.0 mL 乙腈，渦旋提取2 min，超聲10 min 后離心。取25.0 mL 乙腈層于雞心瓶中旋轉蒸至近干，加入5 mL 二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液復溶。樣品液待凈化。

（2）凈化。用5 mL 二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液活化中性氧化鋁固相萃取柱,將待凈化樣品液過活化后的中性氧化鋁固相萃取柱，再用10 mL 二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液分3 次沖洗雞心瓶，將液體轉移至活化后的中性氧化鋁固相萃取柱，將濾出液體收集，氮吹至近干后加入1.0 mL 甲醇渦旋后過0.45 μm 有機膜上機。

1.2.3 加標回收

對花椒進行0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、1.00 mg/kg，3 個濃度的加標回收實驗，每個濃度重復處理3 次。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

使用不同濃度吡蟲啉的標準工作液：0.1 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL 和3.2 μg/mL，在上述色譜條件下，以各濃度對應的峰面積得出標準曲線見圖1。由圖1 可知，吡蟲啉標準曲線回歸方程為y=0.850 7x-0.017 2，R2=1.0。測定的樣品濃度均在標準曲線范圍內。

圖1 吡蟲啉標準曲線

2.2 流動相的選擇

由圖2 可知，GB/T 23379—2009 中使用的流動相為0.1%磷酸水與乙腈梯度，樣品中目標峰與樣品的雜峰混為一體分不開，不能將樣品中的吡蟲啉分離出來且分離時間較長。通過乙腈與水的不同比例（20 ∶80、30 ∶70、40 ∶60，V/V）調整目標化合物的出峰時間，最終選擇流動相為乙腈∶水（30 ∶70）。樣品基線平穩，目標峰分離效果好。

圖2 兩種流動相吡蟲啉加標樣品的液相色譜圖

2.3 樣品前處理方法的改進

①用二氯甲烷直接提取，吸取二氯甲烷氮吹至近干，用甲醇復溶上機測定；②樣品中加入氯化鈉、甲醇/乙腈進行提取，吸取甲醇溶液氮吹至近干，用二氯甲烷∶甲醇（99∶1）溶液復溶過固相萃取柱，收集濾液氮吹至近干，用甲醇復溶；③樣品中適量水浸泡5 min,再依次加入氯化鈉、乙腈進行提取，吸取乙腈層溶液氮吹至近干，用二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液復溶過固相萃取柱，收集濾液氮吹至近干，用甲醇復溶。

根據吡蟲啉的化學性質，吡蟲啉在二氯甲烷的溶解度為50～100 g/L（20 ℃）。用第①方法，用二氯甲烷直接提取，但提取效果只有30%左右。吡蟲啉有一定的極性，樣品中的吡蟲啉很難直接溶于二氯甲烷中，需用其他試劑將提取的溶液全部轉化到二氯甲烷中。選用甲醇和乙腈兩種有機試劑，還考慮到花椒的主要的風味特征“麻”“香”，其揮發油是香味物質的代表性成分。要對樣品基質選擇凈化處理，選用了C18、氨基柱、中性氧化鋁3 種固相萃取柱。凈化不僅僅要除掉有機大分子，更要除去樣品基質中存在揮發油類物質。選用第②方法比較了兩種提取液甲醇、乙腈在這3 種固相萃取柱中的回收率。結果表明，乙腈比甲醇提取率要高。C18固相萃取柱和氨基柱對樣品凈化效果不明顯，中性氧化鋁可以有效地去除樣品中的油脂大分子，無雜峰，分離效果好。但回收率在59.0%～71.3%，樣品前處理中還是存在問題?？紤]其樣品中水分含量比較低，烘干后花椒水分小于10%。樣品基質提取物較多，干擾較大，樣品中水分不易分離。選用第③方法對樣品前處理中先加入適量的水后在進行提取，實驗表明該方法可以有效提高其提取效率。對樣品中添加不同水量比較其樣品回收率結果如表1。

表1 不同加水量對花椒提取效果回收率比較

花椒的前處理過程中先要加入適量蒸餾水浸泡，再依次加入氯化鈉、乙腈進行提取，氯化鈉在乙腈中的溶解能力很弱，易溶于水。含鹽的水溶液會降低原來可溶于水的溶劑的溶解度。有利于乙腈與水的分層，使農藥殘留目標物更完全地溶于乙腈中。洗脫液選用二氯甲烷，吡蟲啉有一定的極性，用純的二氯甲烷復溶效果不好。不同比例的二氯甲烷∶甲醇，會直接影響洗脫效果，如表2 可知，當甲醇體積分數為1%～9%時，吡蟲啉的回收率比較穩定。二氯甲烷與甲醇（99 ∶1）相結合時，吡蟲啉可以完全吸收。

表2 甲醇在二氯甲烷中的不同比例回收率的比較

3 結論

韓國和歐盟頒布的花椒中吡蟲啉殘留量限量標準要求0.05 mg/kg。本實驗中采用高效液相色譜測定方法。經過筆者多次對樣品前處理不斷進行優化，得出了檢測花椒中吡蟲啉殘留量的最佳前處理處理方法及樣品前處理中的加水量。添加濃度在0.05～1.00 mg/kg 內線性關系良好，方法回收率高、準確度高均符合要求。實驗研究的方法能將吡蟲啉和雜質完全分離。樣品前處理過程中操作便利性強、檢測時間短，并且檢測結果精準?？梢詾闇y定花椒中的吡蟲啉殘留量提供借鑒和參考。