叉頭框蛋白O與惡性腫瘤的研究進展△

翁小坤，孫菲，于靜萍

南京醫科大學附屬常州第二人民醫院放療科，江蘇 常州 213003

近年來，惡性腫瘤的發病率逐年上升，臨床現有的治療手段，如手術、放療、化療及免疫治療等均無法達到理想的治療效果。叉頭框蛋白O（forkhead box O，FOXO）可在多個方面對放療、化療、免疫治療等發揮增敏作用，對其進行深入研究，可為臨床惡性腫瘤的治療提供新思路，本文就近年來FOXO的研究進展進行綜述。

1 FOXO概述

叉頭框蛋白（forkhead box，FOX）家族屬于進化較為保守的蛋白質轉錄因子家族，由3個α-螺旋和2個環或“翼”結構域組成。FOXO蛋白家族是一種普遍表達的轉錄因子，在高等生物中發揮重要作用。FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6主要在哺乳動物中發揮作用，但其在組織中表達情況并不相同，FOXO1、FOXO3a和FOXO4在心、腦、腎、肌肉、脂肪等組織中廣泛表達，但FOXO6目前僅表達于中樞神經系統。上述轉錄因子均有一個叉狀的DNA結合區域，受磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號轉導通路調控，參與細胞的周期阻滯、DNA損傷修復及凋亡等過程。此外，有研究表明，FOXO基因家族通過調節轉錄因子的特異性激活來調控機體生長發育、能量代謝及腫瘤的發生發展過程。

2 FOXO的作用機制

FOXO是PI3K/AKT信號通路的下游靶點，并通過生長因子/PI3K/AKT通路對FOXO進行負調控。生長因子與受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）結合可使RTK通過自身磷酸化而活化。活化的RTK可通過RTK或銜接蛋白細胞尾部的磷酸酪氨酸位點募集PI3K并使其激活，從而進一步活化磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3）?；罨腜IP3可導致AKT活化，而活化AKT又可導致FOXO的磷酸化。14-3-3蛋白可以與磷酸化的FOXO結合，并將其從細胞核轉運至細胞質，從而抑制其轉錄功能。相反，c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）及蛋白激酶（mammalian Ste20-like kinase，MST）活化可導致FOXO3a或14-3-3蛋白的磷酸化，使FOXO3a與14-3-3蛋白在細胞質中解離，從而導致FOXO3a重新向細胞核移位。此外，AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]可介導FOXO的磷酸化，并增強其轉錄活性，但卻不改變 FOXO的細胞定位。IκB激酶（IκB-kinase，IKK）可不依賴AKT而直接與FOXO3a相互作用使其磷酸化，并導致FOXO3a的降解。激活的FOXO通過下游的細胞死亡調解因子（Bim）、脂肪酸合成酶配體（fatty acid synthase-ligand，FAS-L）、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）等調控細胞的凋亡過程。FOXO3a激活后可移位至細胞核靶基因，激活FAS-L以誘導細胞凋亡。此外，FOXO3a激活后可與Bim啟動子結合上調Bim的表達，與B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）家族結合進一步激活胱天蛋白酶（caspase）和凋亡效應蛋白[Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）、Bak]，以引起細胞凋亡。FOXO還可通過TRAIL，激活TRAIL受體1（TRAIL receptor 1，TRAILR1，又稱DR4）和TRAILR2（又稱DR5）以促進細胞凋亡。此外，TRAIL與DR4、DR5結合并募集死亡結構域銜接分子（fas-associated protein with death domain，FADD）與caspase 8形成信號轉導復合物，導致caspase 8的自催化活化，經caspase 3觸發caspase級聯反應以誘導凋亡性細胞凋亡。

生理狀態下，通過上述通路，可使FOXO在磷酸化與去磷酸化間維持平衡，在細胞核與細胞質間穿梭維持正常水平，在促進細胞凋亡與促進細胞增殖間保持平衡。但在病理狀態下，FOXO上的AKT、ERK、IKK等激酶異常激活，導致FOXO的大量磷酸化，使大量FOXO從細胞核排出，并通過泛素/蛋白酶體途徑降解，而這種磷酸化失調引起的FOXO降解可導致細胞的代謝水平失調。

3 FOXO與惡性腫瘤的關系

3.1 抑制腫瘤的發生發展

細胞在氧化應激和缺氧等應激條件下?？砂l生癌變，最終形成腫瘤，哺乳動物FOXO基因表達的蛋白是一種多效轉錄因子，參與調節對細胞存活至關重要的廣泛通路。研究表明，敲除FOXO3a會增加胸腺淋巴瘤及血管瘤的發生率，這多與FOXO3a的異常轉錄后修飾相關，而這多與上游PI3K/AKT等激酶異常激活導致FOXO的磷酸化失調有關。大量上游激酶過度激活后，引起大量FOXO的磷酸化，使其從細胞核排出至細胞質中被降解，抑制細胞凋亡等途徑，從而促進細胞的增殖和癌變。

FOXO也被證明抑制腫瘤細胞轉移的作用，這可能是因為其上游通路激活減少，導致FOXO磷酸化水平減少，細胞核中發揮功能的FOXO含量增加。FOXO表達與前列腺癌的轉移呈反比，敲低FOXO4可促進前列腺癌的淋巴結轉移，這種轉移與PIP、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制性蛋白1（calmodulin dependent protein kinase Ⅱ inhibitor 1，CAMK2N1）、脂肪特異性磷脂酶A2（adipose-specific phospholipase A2，PLA2G16）和胃泌素（progastricsin，PGC）等基因相關，敲低上述基因可以減少FOXO4低表達引起的淋巴結轉移。FOXO1及FOXO4的表達可以通過負調控RUNX2的轉錄活性而抑制前列腺癌細胞遷移和侵襲。FOXO1還可以直接與RUNX2結合，抑制與RUNX2結合的轉移基因如白細胞介素-8（interleukin 8，IL-8）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質金屬肽酶13（matrix metallopeptidase 13，MMP13）的啟動子，來減少腫瘤細胞轉移。FOXO4還可增強膜聯蛋白A8（annexin 8，ANXA8）的表達，從而抑制膽管癌中生長因子介導的腫瘤轉移。此外，FOXO1也可以通過抑制上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程達到抑制腫瘤轉移的目的。持續的腫瘤血管生成是腫瘤侵襲獲取營養的關鍵，而FOXO1和FOXO3可通過限制內皮細胞遷移和管腔形成導致血管生成受阻，進一步抑制腫瘤轉移。由此可見，FOXO基因的表達可以有效抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移過程。

3.2 促進腫瘤的發生

越來越多研究表明，FOXO可促進腫瘤的發生和發展，但其具體機制尚未完全明確，可能與其上游激酶的異常調節相關。研究發現，FOXO6在乳腺癌、膀胱癌、胃癌及腦腫瘤組織中表達上調。FOXO還對慢性和急性髓性白血病中的腫瘤細胞生長和維持有支持作用，其主要通過與轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號轉導通路的相互作用介導。FOXO因子和TGF-β/BMP可以在轉錄水平上調節真核細胞生長正調節因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，MTORC1）水平，從而導致干細胞過度增殖，最終促進腫瘤的生長。

3.3 抗腫瘤治療

FOXO轉錄因子在上游PI3K、AKT等的激酶調控下參與了腫瘤發生發展的多個過程，因此，對FOXO深入研究有助于抗腫瘤治療。調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）在維持自身免疫耐受和預防自身免疫疾病方面有重要意義。Treg細胞在惡性腫瘤患者中表達上調，且可能會被募集到腫瘤組織中以促進細胞免疫耐受，從而促進腫瘤的生長。但對于AKT不敏感的FOXO1突變體來說，FOXO轉錄因子可阻斷Treg細胞歸巢至非淋巴器官，從而抑制腫瘤的生長。由此可見，研究FOXO1突變與Treg細胞的關系可能可通過免疫途徑進行腫瘤治療。

FOXO轉錄因子可通過Bim介導伊馬替尼對BCR/ABL基因融合突變白血病細胞凋亡的促進作用；其他抗腫瘤藥物，如曲妥珠單抗，也可激活FOXO介導腫瘤細胞凋亡。上述抗腫瘤藥物主要作為PI3K/AKT通路抑制劑來促進FOXO的激活，但其在利用FOXO進行治療腫瘤時也會引起耐藥，主要耐藥機制包括以下兩個方面：①FOXO1可上調腫瘤細胞中多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR1）的表達。②FOXO激活與PI3K的反饋回環，促進耐藥。研究發現，在PI3K/AKT通路過度激活的腫瘤細胞中，PI3K/AKT抑制劑在促進FOXO活化、抑制腫瘤生長的同時，FOXO蛋白的過表達可反饋性引起AKT的活化和磷酸化，從而導致FOXO失活，形成耐藥。此外，一些抗腫瘤藥物可通過促進腫瘤細胞的氧化應激反應而發揮細胞毒性作用，而FOXO可誘導抗氧化酶的表達保護使腫瘤細胞免受其細胞毒性作用來減弱藥物的抗腫瘤作用。

因放療可精確照射腫瘤病灶發揮重要的抗腫瘤作用，FOXO對于放療的敏感性極為重要，而DNA損傷修復是放療療效的決定性因素。電離輻射在照射腫瘤組織時，射線作用于細胞間水分子及其他分子，導致其電離產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和其他有害物質。ROS和有害物質可與脂質、DNA及蛋白質結合并對其造成損害，從而促進腫瘤細胞凋亡以達到抗腫瘤治療的目的。電離輻射還可直接照射在腫瘤細胞的DNA上，導致DNA單鏈或雙鏈斷裂引起腫瘤細胞凋亡來達到抗治療腫瘤的目的。DNA損傷后可通過阻滯細胞周期、影響細胞的自噬過程、改善組織細胞的乏氧狀態等，修復DNA引起的放療抵抗。DNA損傷時可激活共濟失調毛細血管擴張RAD3相關蛋白（ataxia telangiectasia and Rad 3-related protein，ATR），進一步激活細胞周期檢查點（checkpoint 1，CHK1），將細胞周期阻滯于S期及G/M期，進而促進DNA損傷修復。DNA雙鏈損傷時可以激活毛細血管擴張性共濟失調突變基因（ataxia telangiectasiamutated gene，ATM）進一步上調P21的表達，并誘導細胞周期G期停滯；CHK2和乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene l，BRCA1）可誘導細胞周期S期和G/M期停滯，為DNA損傷修復提供時間。ATM還可以通過非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）及同源重組（homologous recombination，HR）參與DNA的損傷修復過程。此外，DNA損傷時，DNA依賴性蛋白激酶催化亞基（DNA-dependent protein kinase,catalytic subunit，DNA-PKcs）與 Ku70/80 異二聚體形成結合DNA-PK全酶，然后通過與NHEJ介導斷裂的DNA末端直接相連，達到修復DNA的目的。多項研究發現，FOXO3丟失可導致原始造血干細胞和祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）中DNA損傷的累積，特別是與修復氧化性DNA損傷的基因表達下調有關。FOXO3a過表達與哺乳動物的生存期延長有關，且這可能與FOXO3a參與DNA的損傷修復過程有關。DNA受射線照射損傷時，可以觸發FOXO3a在細胞周期中的兩個關鍵檢查點（G/S和G/M），有效將細胞周期阻滯于G、G期，從而延長細胞周期由G期向S期及G期向M期進展的時間。此外，FOXO因子還可以與DNA結合以誘導DNA的損傷修復，這可能與涉及的基因啟動子的位點有關。FOXO3a還可與ATM結合，并通過ATM的磷酸化來激活，從而進一步導致DNA的損傷修復過程。FOXO3a缺失的造血干細胞似乎更容易發生受損DNA的累積與染色體異常。這主要是因為FOXO3a缺失可導致堿基切除修復（base-excision repair，BER）相關的多種關鍵基因，如 DNA 聚合酶β（DNA polymerase β，POLB）、X 線修復交叉互補蛋白1（X-ray repair cross complementing 1，XRCC1）、DNA連接酶1（DNA ligase 1，LIG1）及核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）的表達明顯下調，導致細胞DNA損傷修復功能受損，從而引起受損DNA的累積。由此可見，上游通路通過抑制FOXO的激活來減少DNA的損傷修復，以降低放療抵抗，從而增加放療療效。

FOXO1因子轉錄活性的增強不僅可上調自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）的表達，還可通過雌三醇（sestrin3，SESN3）基因的轉錄抑制雷帕霉素（mechanistic target of rapamycin，MTOR）機制性靶標，誘導自噬的增強。研究顯示，通過抑制腫瘤細胞自噬可發揮良好的抗腫瘤治療效果，這是因為化療期間自噬可能作為保護機制誘發耐藥，最終導致多藥耐藥。自噬還可以通過清除X線照射產生的有毒物質（如自由基、受損的蛋白質或細胞器），從而達到保護細胞的作用，引起腫瘤細胞的放療抵抗。通過使用自噬抑制劑和自噬相關基因（如BECN1、ATG）的遺傳沉默或敲低，具有增加腫瘤細胞放射敏感性的潛力。考慮到FOXO可以促進腫瘤細胞的自噬，或許可通過靶向FOXO調控腫瘤細胞的自噬過程，為抗腫瘤治療提供新方案。

4 小結與展望

近年來，腫瘤已經是人類死亡的主要原因，而多種腫瘤的發生發展過程與人體內信號轉導失衡有關。盡管目前對信號轉導的研究有了較大的進展，并研制出了相應藥物，但仍存在多種難以理解的耐藥機制。因此，明確細胞信號轉導機制，據此研制新型抗腫瘤藥物顯得格外重要，而PI3K、AKT、IKK等上游激酶代謝失調引起體內FOXO代謝失衡是導致腫瘤發生發展的主要原因之一。因此，研究FOXO信號通路可以為減少腫瘤發生風險及抗腫瘤治療提供一種新思路。

FOXO作為一種轉錄因子，其激活被可通過促進細胞凋亡、抑制增殖而達到抗腫瘤治療的目的，FOXO也可通過Treg的作用來增強免疫治療療效。且FOXO可以增強自噬而發揮放化療增敏作用，但抑制FOXO的活化又可減少DNA損傷修復而增強放療療效。此外，FOXO可促進腫瘤細胞發生轉移，表明其在腫瘤的發生發展過程中的作用較為復雜，但造成這種作用的原因尚不明確。FOXO可影響人體正常的代謝過程，其持續性激活會導致人體正常生理功能紊亂，導致人體無法耐受。

本文簡略討論了FOXO基因對腫瘤發生發展的影響，其失衡與腫瘤的發生發展密切相關，而干擾其上游通路可影響FOXO的活化狀態，因此，對這些通路的研究可能有助于開發抗腫瘤治療新型藥物。