六方氮化硼納米片改進(jìn)QuEChERS法凈化草莓中10種農(nóng)藥殘留

趙燕芳，李慧娟，謝含儀，陳相峰

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測(cè)試中心，山東濟(jì)南 250014)

草莓是一種小型水果，具有吸引人的顏色和獨(dú)特的風(fēng)味，富含有益于人體健康的化合物，并且熱量值相對(duì)較低，因而成為最受人們歡迎的水果之一[1]。草莓可以以新鮮、冷凍或加工等形式存儲(chǔ)、食用，因?yàn)楹性S多重要的膳食成分，包括礦物質(zhì)、纖維，以及豐富的植物素(鞣花酸、花青素、槲皮素和兒茶素)和維生素(抗壞血酸和葉酸)，所以被列為多酚和抗氧化能力的膳食來(lái)源之一[2]。為了提高草莓產(chǎn)量和質(zhì)量，農(nóng)藥在草莓生長(zhǎng)過(guò)程中起著不可替代的作用；然而，不規(guī)范使用農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致草莓農(nóng)藥殘留甚至超標(biāo)，嚴(yán)重影響環(huán)境安全、出口貿(mào)易以及消費(fèi)者身體健康[3-4]，因此，草莓中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)是一個(gè)非常重要的課題。

常用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的技術(shù)包括氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、氣相色譜質(zhì)譜法[7]和液相色譜質(zhì)譜法[8]。樣品前處理是農(nóng)藥殘留檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了避免復(fù)雜基質(zhì)的干擾，樣品前處理的關(guān)鍵步驟是樣品提取液的凈化。由于植物樣品中含有大量的色素、氨基酸、生物堿等成分，因此在提取過(guò)程中這些物質(zhì)會(huì)隨著目標(biāo)有害物共提取出來(lái)[9]。該類共提取雜質(zhì)會(huì)給檢測(cè)過(guò)程帶來(lái)諸多問(wèn)題，如污染色譜柱、離子源以及干擾目標(biāo)物的檢測(cè)結(jié)果，造成假陽(yáng)性等問(wèn)題。最常用的提取技術(shù)有固相萃取(SPE)法[10]、液-液萃取法[11]、滲透凝膠色譜[12]和QuEChERS(快速-簡(jiǎn)單-廉價(jià)-高效-耐用-安全)法[13]等。傳統(tǒng)的固相萃取法的選擇性不強(qiáng)，無(wú)法建立綜合的多殘留分析方法。液-液萃取法基于相似相溶原理，不適于性質(zhì)差異較大的多種殘留的凈化。常規(guī)的凝膠滲透色譜儀器昂貴，且耗時(shí)長(zhǎng)，消耗有機(jī)試劑。使用固相萃取法和離線滲透凝膠色譜法時(shí)，存在工作效率低和操作繁瑣等問(wèn)題，因此QuEChERS法以操作簡(jiǎn)便和快速的特點(diǎn)，成為最常用的前處理方法之一。QuEChERS法通常采用N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化碳黑等作為固相吸附提取液中的雜質(zhì)，在去除色素及中弱極性干擾物時(shí)存在凈化效果不足問(wèn)題，因此需要開(kāi)發(fā)具有吸附多種雜質(zhì)新型固定相，實(shí)現(xiàn)提取液的凈化。

六方氮化硼(hexagonal boron nitride, h-BN)納米材料以等數(shù)目的氮原子和硼原子通過(guò)sp2雜化方式結(jié)合成六元環(huán)，每個(gè)B、N原子提供一個(gè)p軌道形成共軛π鍵[14]，具有良好的生物相容性和吸附性能。Jia等[15]制備了大比表面積(大于1 400 m2/g)的多孔h-BN納米材料，用于吸附水中的多種有機(jī)物，發(fā)現(xiàn)該材料能吸附其自身質(zhì)量33倍的污染物。Wang等[16]將h-BN作為基質(zhì)用于基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜法(MALDI-TOF)分析小分子，較傳統(tǒng)基質(zhì)具有較小的背景干擾，提高了靈敏度。Furuhashi等[17]發(fā)現(xiàn)h-BN保留的磷酸化肽段的數(shù)量為C18和石墨化碳黑之和，可用來(lái)吸附化學(xué)性質(zhì)較寬范圍的肽段。h-BN納米材料的獨(dú)特性質(zhì)已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但是尚未見(jiàn)其用于樣品基質(zhì)凈化的應(yīng)用。

本文中首次利用一種大比表面積的二維h-BN納米片作為吸附固定相，采用分散固相萃取技術(shù)改進(jìn)QuEChERS法，建立一種草莓樣品中多種農(nóng)藥殘留的快速、簡(jiǎn)便、有效前處理方法，進(jìn)一步結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法開(kāi)發(fā)10種農(nóng)藥殘留的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

主要儀器包括：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，Triple QuadTM 5500 AB SCIEX型，美國(guó)AB SCIEX有限公司；管式爐，OTF-1200X型，安徽合肥科晶材料科技有限公司；烘箱，DGX-9053B型，上海南榮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋，6HZ-A型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)，MULTIFUGE XIR型，美國(guó)Thermo Scientific公司；真空干燥箱，DZF-6094型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

主要試劑包括：甲醇(CH3OH，CAS 67-56-1)、乙腈(CH3CN，CAS 75-05-8)，色譜純，美國(guó)新天地有限公司；氯化鈉(NaCl，CAS 7647-14-5)，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4，CAS 7487-88-9)，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；有機(jī)污染物相關(guān)化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度大于95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，德國(guó)Dr公司。單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為10 mg/L。

1.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱，Thermo Fisher Scientific C18型, 粒徑為2.6 μm, 2.1 mm×100 mm(內(nèi)徑×長(zhǎng)度)； 流動(dòng)相為甲酸銨(濃度為10 mmol/L)和乙腈，洗脫模式采用線性梯度洗脫。洗脫條件見(jiàn)表1，洗脫速率為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL，色譜柱溫度為30 ℃，樣品盤溫度為10 ℃。

表1 高效液相色譜洗脫條件

質(zhì)譜條件： 離子源為電噴霧(ESI)離子源，使用正離子掃描模式。電噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃。氣簾氣壓力為138 kPa，碰撞氣壓力為50 kPa，霧化氣壓力為345 kPa，輔助氣壓力為345 kPa。入口電壓為10 V，碰撞室出口電壓為13 V。監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

1.3 h-BN納米片的制備

h-BN納米片制備方法依據(jù)文獻(xiàn)[18]并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，步驟如下：在容積為50 mL的離心管中加入甲醇(10 mL)和水(10 mL)的混合液，然后分別加入物質(zhì)的量分別為0.15、0.05 mol的尿素、硼酸，上述混合液在室溫下水浴振蕩1 h，然后在50 ℃烘箱中加熱12 h，將得到的白色固體轉(zhuǎn)移到石英舟中在管式爐中煅燒，氣氛為氮?dú)猓褵郎囟葹?00 ℃，保溫時(shí)間為2 h，得到的白色粉末用無(wú)水乙醇離心洗滌3次，在溫度為70 ℃時(shí)真空干燥2 h。

1.4 樣品前處理

1)草莓樣品處理。將草莓樣品洗干凈，取可食用部分置于攪碎機(jī)里攪碎，勻漿，裝入潔凈的離心管內(nèi)，密封并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣于-20 ℃冷凍保存。

2)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。稱取10 g勻漿后的空白草莓漿，置于50 mL離心管中，加入一定量的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋1 min，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，再加入2 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂，離心分離，取上清液置于50 mL離心管中，加入4 mg h-BN納米片，渦旋1 min，在轉(zhuǎn)速為8 000 r/min時(shí)離心分離，上清液過(guò)孔徑為0.22 μm的濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

3)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。稱取10 g勻漿后的空白基質(zhì)樣品，置于50 mL離心管中，加入一定量的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋1 min，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，再加入2 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂，離心分離，取上清液置于50 mL離心管中，加入4 mg h-BN納米片，渦旋1 min，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min下離心分離，上清液過(guò)孔徑為0.22 μm的濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 h-BN納米片的表征

h-BN納米片的微觀形貌圖像及吸附-脫附等溫曲線見(jiàn)圖1。由圖1(a)、(b)可以看出，h-BN納米片具有二維的類似石墨烯的形貌； 由圖1(c)可以推算出h-BN納米片的比表面積很大，數(shù)值約為2 000 m2/g。h-BN納米片這種類石墨烯的結(jié)構(gòu)及大的比表面積有助于對(duì)檢測(cè)樣品中雜質(zhì)的吸附和對(duì)復(fù)雜基質(zhì)凈化。

(a)掃描電子顯微鏡圖像

(b)透射電子顯微鏡圖像

(c)吸附-脫附等溫曲線圖1 六方氮化硼納米片的微觀形貌圖像及 吸附-脫附等溫曲線

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

在液相色譜分析中，流動(dòng)相的組成是一個(gè)重要因素，不僅影響目標(biāo)物的色譜峰型和分離效果，也會(huì)影響檢測(cè)器的信號(hào)響應(yīng)和檢測(cè)靈敏度。色譜優(yōu)化過(guò)程以信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度、峰型和干擾程度作為評(píng)價(jià)效果的依據(jù)。選用濃度為10 mmol/L的甲酸銨和乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到草莓樣品中10種農(nóng)藥殘留化合物的保留時(shí)間色譜圖，如圖2所示。

圖2 草莓樣品中10種農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間色譜圖

2.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

優(yōu)化三重四極桿質(zhì)譜是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，原因是每個(gè)目標(biāo)化合物都需要特定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析。為了找出保留時(shí)間和分析物峰之間的最佳分辨率，使用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在全掃描模式下進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)。串聯(lián)質(zhì)譜探測(cè)器具有較高的選擇性和靈敏度，重點(diǎn)考慮的是母離子、子離子的選擇，以及最佳反應(yīng)的碰撞能量的優(yōu)化。質(zhì)譜參數(shù)選擇首先對(duì)化合物進(jìn)行全面掃描，然后選擇每個(gè)分析物的母離子，繼而優(yōu)化碰撞能量電壓來(lái)生成產(chǎn)物離子。進(jìn)一步優(yōu)化每個(gè)化合物在MRM獲取過(guò)程中的特征離子躍遷和碰撞能量，進(jìn)行定量分析。各化合物參考保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)(同一化合物的母離子對(duì)應(yīng)不同的子離子)、去簇電壓(DP)、碰撞能量電壓(CE)參考值見(jiàn)表2。

2.3 凈化條件優(yōu)化

2.3.1 h-BN納米片用量

為了得到較大的回收率及可以重現(xiàn)的色譜峰強(qiáng)度，去除基質(zhì)中的干擾物質(zhì)是必要的。本文中提出用QuEChERS法凈化草莓樣品中基質(zhì)干擾物，無(wú)水硫酸鎂用于去除基質(zhì)中的水分，h-BN納米片用于去除其他干擾物質(zhì)，如脂肪酸、色素和其他基質(zhì)化合物。研究發(fā)現(xiàn)，h-BN納米片可以作為QuEChERS法中的替代材料，用于分散固相萃取基質(zhì)中干擾物來(lái)凈化草莓樣品。圖3所示為h-BN納米片用量條件優(yōu)化結(jié)果。從圖中可以看出：少量的h-BN納米片 (小于4 mg)不能獲得最大回收率，原因可能是吸附劑的用量較少，不能很好地凈化樣品基質(zhì)；當(dāng)h-BN納米片用量為4 mg時(shí)，回收率達(dá)到最大值，并且經(jīng)過(guò)處理的最終樣品顏色透明；當(dāng)h-BN納米片用量過(guò)多時(shí)，可能導(dǎo)致吸附大多數(shù)加標(biāo)的農(nóng)藥。本文中選用4 mg為h-BN納米片的最佳用量。

表2 草莓樣品中10種農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓、碰撞電壓參數(shù)

圖3 10種農(nóng)藥殘留回收率與六方氮化硼納米片用量的關(guān)系

2.3.2 凈化時(shí)間

凈化時(shí)間也是影響凈化效果的一個(gè)重要因素。凈化時(shí)間為20～100 s時(shí)對(duì)不同目標(biāo)物(質(zhì)量比為100 mg/kg)回收率的影響見(jiàn)圖4。由圖可以看出：凈化初始時(shí)目標(biāo)物的回收率較小，原因是凈化時(shí)間過(guò)短，不能使h-BN納米片充分凈化草莓樣品基質(zhì)，干擾了目標(biāo)物的測(cè)定。凈化時(shí)間為60 s時(shí)，凈化劑充分發(fā)揮了凈化作用，目標(biāo)物回收率最大。隨著凈化時(shí)間繼續(xù)增加，目標(biāo)物的回收率減小，原因可能是凈化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，h-BN納米片對(duì)目標(biāo)物有部分吸附。實(shí)驗(yàn)最終選定60 s作為最佳凈化時(shí)間。

圖4 10種農(nóng)藥殘留回收率與凈化時(shí)間的關(guān)系

2.4 方法建立

草莓中10種農(nóng)藥殘留的分析結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，10種農(nóng)殘質(zhì)量比線性范圍均為0.1～500 mg/kg，相關(guān)系數(shù)r為0.999 2～0.999 8，方法檢出限(信噪比為3)為0.000 5～0.01 mg/kg，定量限(信噪比為10)為0.002～0.003 mg/kg。采用質(zhì)量比為100 mg/kg的10種農(nóng)藥殘留進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%～5.98%(n=5,n為測(cè)定次數(shù))，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.24%～5.32%(n=5)，不同批次合成的h-BN納米片的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.25%～6.25%(n=5)。上述結(jié)果表明，h-BN納米片可以改進(jìn)QuEChERS法凈化草莓樣品中農(nóng)藥殘留污染物。

表3 草莓中10種農(nóng)藥殘留的分析結(jié)果

2.5 樣品分析

將基于h-BN納米片改進(jìn)的QuEChERS法用于草莓樣品中10種農(nóng)藥殘留污染物的凈化，在草莓樣品中加入農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量作為加標(biāo)量(質(zhì)量比分別為1、10、50 mg/kg)，對(duì)于加標(biāo)樣品也進(jìn)行同樣的前處理。進(jìn)一步結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析實(shí)際樣品中痕量農(nóng)藥殘留污染物，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可以看出，樣品的回收率為86.03%～106.3%，表明該方法結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可應(yīng)用于草莓實(shí)際樣品中痕量農(nóng)藥殘留的分析。

3 結(jié)論

本文中首次利用h-BN納米片改進(jìn)的QuEChERS法，建立了一種快速、靈敏的草莓樣品中多種農(nóng)藥殘留分析方法，得到以下主要結(jié)論：

1)h-BN納米片用于分散固相萃取法，可以有效凈化基質(zhì)中農(nóng)藥提取物。萃取后的凈化過(guò)程主要是去除基質(zhì)中的干擾物質(zhì)，而不是提取和分離分析物。

2)h-BN納米片可以快速、有效地吸附樣品中色素等干擾物，凈化基質(zhì)，并結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可以分析樣品中痕量農(nóng)藥殘留。

3)該方法的線性范圍、精密度、回收率均符合農(nóng)藥分析的要求，結(jié)果證實(shí)了該方法的可行性，可用于草莓產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的常規(guī)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，為痕量農(nóng)藥分析和樣品清理找到有效途徑，有望廣泛應(yīng)用于各種水果中微量農(nóng)藥的監(jiān)測(cè)。

表4 草莓樣品中10種農(nóng)藥殘留污染物不同加標(biāo)量(質(zhì)量比)回收率結(jié)果