腎缺血再灌注損傷中壞死性凋亡的研究進展

匡柏成，張季，宮念樵

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院器官移植研究所 器官移植教育部重點實驗室 國家衛生健康委員會器官移植重點實驗室 中國醫學科學院器官移植重點實驗室，武漢 430030)

臨床上，血容量不足、心肌梗死、腦梗死、敗血癥或器官移植等均可誘發缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)。腎臟對IRI敏感，在供者器官獲取及移植手術過程中不可避免地會發生IRI，進而導致術后移植物功能恢復延遲、急性或慢性排斥反應及腎纖維化發生，嚴重影響腎移植患者預后[1]。研究者曾嘗試采用機械灌注、缺血預處理及缺血后處理、細胞治療及各種藥物制劑等干預措施，研究其對腎臟IRI的潛在保護作用，但目前臨床尚無有效方法[2-5]。

凋亡和壞死被認為是腎IRI發病機制中細胞死亡的主要形式。細胞凋亡形成凋亡小體，然后由專職或非專職吞噬細胞吞噬、清除，不引起炎癥反應；而細胞壞死則會引起胞內炎性內容物釋放，導致局部嚴重的炎癥反應[6]。隨著對細胞死亡機制研究的深入，壞死性凋亡、鐵壞死、細胞焦亡、依賴性細胞死亡等調節性細胞壞死過程逐漸被人們發現。其中，壞死性凋亡于2005年首次提出[7]，是一種新的程序性細胞死亡方式，參與調控多種急慢性疾病的發展過程。在體內、外腎IRI模型中，壞死性凋亡通路激活，可加重腎IRI，而通過人為干預，抑制壞死性凋亡則可改善IRI后腎功能[8-10]?，F就腎IRI中壞死性凋亡的研究進展予以綜述，以為臨床腎IRI的防治提供新思路。

1 壞死性凋亡概述

壞死性凋亡是一種受調控的細胞程序性死亡途徑，具有細胞壞死和凋亡的混合特征。壞死性凋亡可由多種細胞內外刺激引起，包括病毒感染和氧化應激以及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成員、Fas配體、干擾素等[11-13]。有學者通過對細胞表面死亡受體進行研究發現，對于經胱天蛋白酶(caspase)抑制劑預處理而抑制凋亡的細胞，TNF-α仍可導致其死亡，且表現為具有細胞壞死的形態學特征[14]。另有研究使用Fas配體作為刺激因素，確定了受體相互作用蛋白是caspase-8非依賴的非凋亡細胞壞死的關鍵成分[11]。2005年，Degterev等[7]首次提出“壞死性凋亡”一詞來描述這種受調控的細胞壞死模式。

2 壞死性凋亡分子機制

TNF受體是細胞表面重要的死亡受體，在壞死性凋亡的分子機制研究中，TNF-α是研究最廣泛的壞死性凋亡誘因，細胞壞死性凋亡的啟動及執行依賴于一系列激酶的活化，包括受體相互作用蛋白激酶(receptor-interacting protein kinase，RIPK)1、RIPK3和混合譜系激酶結構域樣假激酶(mixed lineage kinase domain like pseudokinase，MLKL)等[15](圖1)。

2.1復合物Ⅰ的形成 當細胞受到胞內或胞外刺激時，TNF-α與TNF受體1 結合，TNF受體1與TNF受體相關死亡結構域蛋白相互作用，活化并招募各種下游分子，組裝形成由TNF受體1、TNF受體1相關死亡結構域、TNF受體1相關因子2、RIPK1、細胞凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis protein，cIAP)1、cIAP2和線性泛素化鏈組裝復合物組成的復合物Ⅰ[16]。復合物Ⅰ作為一個反應平臺，在決定細胞命運方面至關重要，其中，cIAP1、cIAP2或線性泛素化鏈組裝復合物可泛素化RIPK1，泛素化的RIPK1可穩定復合物Ⅰ，并通過招募轉化生長因子-β活化激酶1或經經典核因子κB通路促進細胞存活[17]。

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；TNFR1：腫瘤壞死因子受體1；RIPK：受體相互作用蛋白激酶；TRAF：腫瘤壞死因子受體相關因子；TRADD：腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域蛋白；cIAP1/2：細胞凋亡抑制蛋白1/2；LUBAC：線性泛素化鏈組裝復合物；caspase-8：胱天蛋白酶8；FADD：Fas相關死亡結構域蛋白；MLKL：混合譜系激酶結構域樣假激酶；p-MLKL：磷酸化的混合譜系激酶結構域樣假激酶；NF-κB：核因子κB

2.2復合物 Ⅱ C的形成 當復合物 Ⅰ 失穩，或cIAP、轉化生長因子-β活化激酶1或核因子κB等必要調節因子消耗時，復合物Ⅰ分別形成復合物ⅡA、ⅡB，導致caspase激活，從而誘導caspase活化依賴的經典細胞凋亡途徑。在caspase-8缺乏、失活或被病毒或化學抑制劑抑制，RIPK1和MLKL充分表達，或長構型Fas相關死亡結構域蛋白樣白細胞介素-1β轉換酶抑制蛋白活性降低的情況下，復合物Ⅰ則形成由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的復合物ⅡC(即壞死性凋亡小體)[18]。復合物 Ⅱ C中的RIPK1和RIPK3，通過其受體相互作用蛋白同型相互作用基序相互結合，發生一系列自磷酸化和反式磷酸化反應而活化，激活的RIPK3通過蘇氨酸357和絲氨酸358位點磷酸化MLKL的假激酶結構域，形成磷酸化的MLKL(phosphorylated mixed lineage kinase domain like pseu-dokinase，p-MLKL)，導致MLKL活化[19]。

2.3壞死性凋亡的執行 MLKL是壞死性凋亡的執行蛋白，具有兩個功能域：N端4-螺旋束結構域和C端RIPK3磷酸化位點的假激酶結構域，兩者在功能上由兩個彎曲的螺旋線橋接。MLKL的磷酸化使MLKL發生構象改變，激活了4-螺旋束結構域的殺傷功能。p-MLKL寡聚并通過與質膜磷脂酰肌醇磷酸鹽結合，從而完成由細胞質向細胞膜的轉位，導致細胞膜通透性改變，誘導細胞溶解，最終導致胞內炎癥損傷相關分子模式的釋放，并促進固有免疫和適應性免疫發生[20]；同時，p-MLKL還可激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體，導致炎癥介質(白細胞介素-1β和白細胞介素-18)分泌，促進炎癥反應的發生、發展[21]；此外，活化的MLKL也可被招募到線粒體膜，導致線粒體功能障礙，最終導致細胞溶解、壞死[22]。

3 腎IRI與壞死性凋亡

盡管壞死性凋亡在一些疾病中的相對重要性仍存在爭議，但其已被報道與多種疾病密切相關，包括心臟IRI、結腸炎、腸IRI等[23-25]。壞死性凋亡可通過誘導細胞釋放損傷相關分子模式，促進免疫反應，在機體病毒感染產生特異性T細胞和B細胞早期發揮重要的抗病毒作用[26]。此外，壞死性凋亡被認為在多種腎損傷模型中發揮作用，包括腎IRI、順鉑誘導的急性腎損傷、造影劑腎病等[27]。

3.1腎IRI中壞死性凋亡的體內研究 腎IRI的發病機制復雜，包括能量代謝障礙、腎小管壞死和凋亡、炎癥產生和氧化應激等。研究表明，抗炎、抗氧化及抑制凋亡等治療均對腎IRI具有保護作用[28-29]。Linkermann等[30]于2012年首次報道了壞死性凋亡存在于腎IRI的病理損傷過程，在缺血30 min、再灌注48 h的小鼠IRI模型中，RIPK1和RIPK3表達水平顯著升高，而在缺血前15 min或再灌注后15 min給予RIPK1特異性抑制劑Nec-1(Necrostatin-1)，可顯著降低腎損傷、保護腎臟功能；同時，在致死的缺血40 min的腎IRI模型中，Nec-1可顯著降低死亡率，提高小鼠存活率。與野生型小鼠相比，RIPK3或MLKL基因敲除小鼠腎缺血30或35 min、再灌注48 h后腎功能改善[31-33]。在腎IRI時，腎臟血流障礙是腎臟功能下降的重要特征，研究者發現，MLKL基因敲除小鼠腎小管周毛細血管表現出更高的血流速度和更強的血流量[31]，但其具體作用機制尚不明確，因此壞死性凋亡相關基因對腎臟血管的影響在腎IRI中的作用機制還需進一步研究。Shen等[34]研究表明，在IRI前給予大鼠 Nec-1預處理可顯著降低腎臟RIPK1、RIPK3蛋白水平，抑制炎癥因子(白細胞介素-1、TNF-α及缺氧誘導因子1α)的表達，保護腎功能。達拉非尼是一種著名的抗癌藥物，目前已被批準用于治療黑色素瘤和某些非小細胞肺癌[35]。研究表明，達拉非尼也有阻斷RIPK3的作用，在缺血30 min、再灌注24 h的小鼠IRI模型中，達拉非尼預處理可明顯降低RIPK3、磷酸化的RIPK3和p-MLKL蛋白水平，減輕腎臟損傷[36-37]。

3.2腎IRI中壞死性凋亡的體外研究 細胞的糖氧剝奪模型，即細胞缺氧/復氧是模擬體內IRI常用的體外損傷模型。Liu等[37]研究表明，人腎近端小管上皮細胞(HK-2細胞)缺氧/復氧損傷(缺氧24 h/復氧12 h)后，壞死性凋亡標志物RIPK3、RIPK1、MLKL表達上調。然而，有研究發現，腎小管上皮細胞缺氧/復氧損傷(缺氧2 h/復氧2、4、8 h)后p-MLKL水平降低，凋亡及自噬相關蛋白水平升高，表明細胞凋亡是缺氧/復氧損傷的主要表現形式，而非壞死性凋亡[38]。腎小管上皮細胞損傷的嚴重程度是決定細胞是否會發生凋亡或壞死的主要因素[39]，因此兩者研究的差異可能與缺氧/復氧時間不同導致的細胞損傷程度不同有關。瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)一種非選擇性陽離子通道，主要表達于腎小管上皮細胞，負責鈣內流和隨后氧化應激期間的細胞損傷[40]。在HK-2細胞缺氧/復氧損傷模型中，敲除TRPC6基因或給予TRPC6抑制劑可促進RIPK1表達，加重HK-2細胞損傷[41]。Shen等[34]發現，缺氧/復氧損傷會誘導氧依賴的轉錄因子-缺氧誘導因子1α釋放，在HK-2細胞缺氧/復氧損傷模型中，缺氧誘導因子1α可間接抑制TRPC6，促進壞死性凋亡，加重細胞損傷。

3.3壞死性凋亡參與腎IRI后腎纖維化 巨噬細胞和T淋巴細胞等炎癥細胞的聚集是導致腎IRI后持續性炎癥和纖維化反應的主要原因[42]，壞死性凋亡不僅參與腎IRI后急性腎小管損傷，還與腎IRI后腎小管間質炎癥及腎纖維化的發生發展密切相關。Lau等[43]在腎移植小鼠模型中，分別通過抑制caspase-8增強壞死性凋亡、敲除RIPK3基因抑制壞死性凋亡發生，結果發現，RIPK3介導的供腎壞死性凋亡可促進炎癥損傷，而抑制壞死性凋亡可顯著減少中性粒細胞浸潤、腎纖維化及血管損傷，提高腎移植術后100 d無排斥存活率，對供腎存活及功能有重要影響。Chen等[44]研究表明，敲除RIPK3或MLKL基因，小鼠腎IRI后壞死性凋亡減輕，腎內巨噬細胞的遷移和浸潤顯著減少，炎癥因子和纖維化標志物(α平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型膠原蛋白)表達水平降低，腎纖維化改善。

4 腎IRI中壞死性凋亡的干預措施

在腎IRI過程中壞死性凋亡發揮重要作用，抑制壞死性凋亡可減輕IRI后腎損傷、改善腎臟功能及腎纖維化。因此，通過藥物、基因敲除或生物制劑干預，特異性阻斷壞死性凋亡通路中的關鍵分子，可用于防治腎IRI，保護腎臟功能。

4.1藥物干預 在體外使用TNF-α或去除ATP模擬的腎IRI模型中，RIPK1抑制劑Nec-1可顯著抑制壞死性凋亡，減輕腎小管細胞損傷[45]。在小鼠腎IRI體內模型中，Nec-1可減輕腎臟病理損傷、保護腎臟功能，顯著降低IRI后小鼠死亡率[34]。研究表明，新型RIPK1抑制劑Nec-1s(Necrostatin-1 stable)較Nec-1更穩定、不良反應更少，且可通過抑制RIPK1的磷酸化和泛素化，對TNF-α誘導的全身炎癥反應綜合征發揮保護作用，可抵御葉酸誘導的急性腎損傷[27]，但有關Nec-1s在腎IRI中的作用報道較少。甲苯磺酸索拉非尼作為RIPK1的另一種抑制劑，也對腎IRI具有保護作用[46]。此外，RIPK3抑制劑GSK843、GSK872和人特異性GSK840均能抑制TNF-α誘導的壞死性凋亡，但它們未在腎IRI中進行測試[47]。目前，抑制MLKL是阻斷壞死性凋亡最明確的藥理學手段，壞死磺酰胺在體外可顯著抑制壞死性凋亡[48]，但其特異性作用于人類MLKL，在嚙齒類動物中研究較少。

4.2基因敲除 基因敲除是常用的體內外實驗技術，通過人為干預使特定的基因喪失功能，進而推測該基因的生物學作用。對基因敲除小鼠的研究支持了壞死性凋亡在腎IRI中的作用。其中，RIPK1基因全身敲除對小鼠致死，出生后存活時間不超過1～2 d[49]，故相關研究主要集中于RIPK3及MLKL基因。Linkermann等[50]在缺血43 min的致死性腎IRI模型中發現，與野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠存活率顯著升高。在標準的缺血30 min的腎IRI小鼠模型中，von M?ssenhausen等[31]通過敲除RIPK3或MLKL基因抑制壞死性凋亡，結果顯示術后小鼠腎功能改善；Newton等[32]發現，RIPK3基因敲除小鼠腎IRI后死亡率降低。雖然以上研究表明，通過敲除壞死性凋亡途徑的某些關鍵分子可改善腎IRI后腎功能，提高小鼠存活率，但特定敲除靶基因后對機體其他組織器官功能的影響目前尚不清楚，需進一步研究。

4.3其他 細胞間或細胞內通過高度精確的細胞通訊機制，對多變的外界環境做出綜合反應，其中化學信號介導的細胞通訊占重要地位。有學者通過對壞死性凋亡作用機制進行深入研究發現，人誘導多能干細胞來源的間充質干細胞的細胞外囊泡通過上調和激活鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇通路抑制腎IRI后的壞死性凋亡，對腎IRI具有保護作用[3]。另有研究表明，重組人巨噬細胞遷移抑制因子通過升高細胞內還原性谷胱甘肽水平和減少脂質過氧化，表現出強大的抗氧化作用，其可減輕腎IRI小鼠的細胞凋亡、壞死性凋亡，在腎IRI模型中顯示良好的保護效果[2]。未來，通過提取與壞死性凋亡相關的細胞分泌物，如具有細胞調控作用的外泌體，可能有助于改進調控壞死性凋亡的方案。

5 小 結

隨著新型免疫抑制劑的產生及手術技術的進步，腎移植術后近期存活率顯著提高，但提高移植物遠期存活率仍是臨床亟待解決的難題。腎IRI影響移植物功能及患者遠期預后，通過抑制壞死性凋亡，可減輕腎IRI，改善小鼠腎移植物功能，降低排斥反應發生率，延長供腎生存時間。而壞死性凋亡在腎IRI中的作用仍需進一步研究：①其下游作用靶點未完全明確；②壞死性凋亡與凋亡在腎IRI中常同時發生，腎IRI后細胞死亡的主要途徑是壞死性凋亡還是凋亡，目前尚無定論；③壞死性凋亡與其他細胞死亡途徑(如細胞焦亡、鐵死亡、依賴性細胞死亡)的聯系及在腎IRI中具體參與的程度目前尚不清楚。雖然壞死性凋亡在防御細菌和病毒感染中具有重要作用[26]，但在腎移植的情況下，抑制接受免疫抑制劑治療的受體的壞死性凋亡可能會增加感染的發生率。然而，干預壞死性凋亡可能只需在圍手術期進行，這可能是一個短期的風險，故其確切影響需進一步基礎實驗驗證。