淺談蛋白質含量的測定

張 琳，顧風云，秦宇婷，姜卓君，劉傳玉

（吉林省產品質量監督檢驗院，吉林長春 130000）

蛋白質是構成生命的重要物質[1]。在人體的細胞和組織中，蛋白質是非常重要的組成成分。在人體中，蛋白質占了人體質量的18%，其與生命現象有著密切的關系。人體內蛋白質的種類很多，但性質和功能各有區別。因此，蛋白質的檢測方法就顯得尤為重要。凱氏定氮法是測定蛋白質含量最為普遍的方法，同時相比較于其他檢測方式，其具有更多優勢[2]，如易于操作、實驗過程安全、成本較為合理、測定結果準確。因此，凱氏定氮法成為食品檢驗工作中普遍的測定方法。

1 實驗儀器與試劑

實驗儀器：電子天平（Metteler Toledo ML204）；石墨消解儀（濟南海能儀器股份有限公司）；全自動凱氏定氮儀（山東海能科學儀器有限公司）。

試劑：硫酸銅；硫酸鉀；硫酸；硼酸；氫氧化鈉；甲基紅指示劑；溴甲酚綠指示劑；95%乙醇溶液。

2 實驗方法

2.1 實驗原理

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨和硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或者鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量計算氮含量。凱氏定氮法的反應過程包含以下幾個方面。

2.2 滴定注意事項

在滴定過程中需要注意以下兩點。①指示劑為甲基紅溴甲酚綠，其在堿性條件下變藍，酸性條件下暗變紅。②催化定氮片。硫酸銅催化劑；硫酸鉀防止暴沸。

2.3 樣品處理及實驗步驟分析

①稱量。固體試樣0.2～2 g、半固體試樣2～5 g，液體試樣10～25 g。②消化。于消化管中加入硫酸銅、硫酸鉀，10 mL濃硫酸后，放置石墨消解爐上消解90 min，消解溫度為420 ℃，消解儀可選用曲線加熱模式和直線加熱模式。③上機。消解后的樣品冷卻后，可上機測試。上機測試前，需要對機器進行清洗，包括接受杯、堿管路，機器，清洗完畢后，先測試空白樣品，再測試樣品。④計算。根據公式可知，試樣的質量、試劑空白滴定液體積、試樣滴定液體積和氮換算為蛋白質的系數是變量，因此，實驗過程中需要關注天平的準確性、消解是否完全、機器清洗是否干凈、空白試劑的滴定體積數以及試驗滴定液體積數是否準確。

3 儀器常規維護保養

①儀器要有良好的通風和散熱條件。②儀器測試時首先進入清洗界面選擇，換酸清洗3次左右，當改變滴定酸的濃度時，用換酸清洗的方法將管路及滴定器中的滴定酸排凈，再用新換酸沖洗至少6次，并及時排液。③測樣前連續做儀器空白測試[3]。等到儀器穩定后可測試樣品（將機器中的堿量調為零，進行測試，當滴定體積之差小于0.05 mL，機器即為穩定）。④每日實驗結束后，清洗接收杯1～2次以及堿管路2次，用洗瓶沖洗蒸餾頭殘余堿液。儀器前部的槽皿中，如果積有液體，將其擦洗干凈。⑤為了延長防濺裝置的使用壽命，請每天工作結束后清洗，即消化管內加入一半左右的蒸餾水（以蒸餾完成消化管液體不溢出為準），上機蒸餾，一般清洗2次左右（空蒸儀器把加堿量設置為“0”）。⑥儀器使用結束后要關閉水源、電源，儀器上要安裝空消化管（防止防濺裝置內殘留液體流到儀器上）。⑦為防止堿路結晶影響儀器壽命，在完成實驗后，進行堿管路清洗。若儀器長時間不用或者使用時間一周以上時，應將堿桶中的堿液換為蒸餾水；將消化管放好，選擇手動加堿，達到清洗管路的作用，防結晶堵塞。⑧堿液桶、硼酸液桶應定期清理沉淀物并清洗干凈。⑨儀器長期使用，在蒸餾瓶中會有水垢產生，將影響加熱效率（建議6個月清理1次）；如使用頻繁，可增加清洗頻率[4]。通過加蒸餾水管路加入除垢劑或一定濃度的弱酸性溶液清洗干凈，按蒸餾水排水閥排凈，再用蒸餾水多次沖洗后將管路連接好。⑩如儀器存放環境溫度低于零度以下應排空儀器內所有液體，以免造成儀器損壞。

4 注意事項

①實驗前，試劑要準備充足，保證滿足本批次實驗；②開機前要打開冷卻循環水，保證冷卻效果；③強酸強堿反應劇烈，建議設置加10～20 mL蒸餾水進行稀釋；④添加氫氧化鉀溶液的體積數為濃硫酸體積的4倍，最為適宜；⑤開始進行蒸餾時，消化管中液體的總體積以不超過總體積的1/3為宜；⑥拿取消化管的過程中需要注意高溫燙傷。在放置消化管時，需要左右旋轉幾下，確保消化管與蒸餾頭密封；⑦禁止使用邊緣有缺口，或者有裂縫的消化管；⑧儀器蒸餾過程中如遇緊急情況，可直接關閉電源開關；⑨排廢液管的出口要比儀器安放位置低，以使排液暢通。

5 實際應用與現狀

在目前檢測中，食品中蛋白質含量測試參照《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016）、《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018），同時，凱氏定氮儀還可以測定食品中揮發性鹽基氮的含量，參照標準為GB 5009.228—2016以及測定大豆肽粉中多肽含量，參照標準為GB/T 22492—2008。凱氏定氮法測量蛋白質含量最為合適[5]。蛋白質的測定有凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法和燃燒法，其具體操作及特點如下。

5.1 凱氏定氮法

準備4個50 mL凱氏燒瓶并標號，向1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化，之后進行蒸餾，全部蒸餾完畢后用標準鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

5.2 雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不干擾顯色，Cu2+與蛋白質的肽鍵以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此絡合物在540 nm波長處有最大吸收。首先利用標準蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標準曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合[6]，并用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，充分混合后于37 ℃環境中放置10 min，在540 nm波長處進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，由標準曲線上直接查出蛋白質含量。雙縮脲法常用于0.5～10 g/L含量的蛋白質溶液測定。

5.3 酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質溶液，不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在室溫下放置30 min，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于650 nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

5.4 紫外吸收法

大多數蛋白質在280 nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1～0.5 mg/mL含量的蛋白質溶液。取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質溶液[7]，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻[8]，在280 nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5.5 燃燒法

試樣在900～1 200 ℃高溫下燃燒，燃燒過程中產生混合氣體，其中碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮氣，形成的氮氣氣流通過熱導檢測器進行檢測。此方法易操作[9]，但需要購買氮/蛋白質分析儀，采購費用比較昂貴。