美洲型與歐洲型PRRSV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立

高 雅，武欣欣，蔣小玲，賀曉霜，肖 興*，周雙海*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 衡陽(yáng)市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 衡陽(yáng) 421001)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種基因組大小約為15 kb的具有囊膜的RNA病毒，現(xiàn)有兩種血清型，即美洲型和歐洲型，兩者不僅在形態(tài)與理化方面相似，在致病性方面也基本相似，都引起同一種疾病，即豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，這是一種以母豬出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)出木乃伊胎等繁殖障礙、仔豬與育成豬出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀和較高病死率的危害很大的主要傳染病[1, 2]。但是，二者在全基因組核苷酸序列同源性方面僅為80%左右，顯示出很大差異[3, 4]。中國(guó)于1996年首次分離到PRRSV美洲型毒株[5]，在2010年首次分離鑒定出PRRSV歐洲型毒株[6]。PRRSV流行毒株在臨床上的多樣性給疫病的診斷和防控帶來(lái)了很大困難。現(xiàn)階段，病毒基因分型檢測(cè)主要使用RT-PCR技術(shù)，為了提高檢測(cè)時(shí)效而多采用多重RT-PCR方法。國(guó)內(nèi)已有少量研究者建立了關(guān)于PRRSV美洲型與歐洲型毒株多重RT-PCR檢測(cè)方法，但其最低檢測(cè)都超過(guò)103copies/μL[7, 8]，這些方法的敏感性明顯不夠高，在應(yīng)用于臨床檢測(cè)時(shí)會(huì)導(dǎo)致不少假陰性結(jié)果。因此，本研究目的是建立一種具有高敏感性的針對(duì)美洲型和歐洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸模板

美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV和豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等病毒核酸模板由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物疫病研究室保存。

1.2 病毒重組質(zhì)粒模板的構(gòu)建

比對(duì)分析PRRSV美洲型毒株、歐洲型毒株的基因序列，之后用分子生物學(xué)軟件primer5.0設(shè)計(jì)出AU與AF、EU與EF等2對(duì)特異性引物，序列分別為 AU(5′-GACACCACCACCCCCTCC-3′)與AF(5′-CGATGATGGCTTGAG CTGAGT-3′)、EU(5′-TTGACTCCGCACTCTTGCTTCT-3′)與EF(5′-GCCCGCCAACAAATCCTG-3′)，預(yù)期目的片段大小分別為650 bp與289 bp。參考文獻(xiàn)[9]中的方法來(lái)分別構(gòu)建美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV基因片段重組質(zhì)粒。

1.3 單項(xiàng)RT-PCR方法條件篩選

單項(xiàng)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)體系是：10 pmol上游引物、10 pmol下游引物、2 μL濃度為105copies/μL數(shù)量級(jí)的病毒重組質(zhì)粒模板、總體積為20 μL。單項(xiàng)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)程序是：95 ℃ 200 s；95 ℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32次循環(huán)；72 ℃ 600 s。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于20 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。以此單項(xiàng)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)體系與基礎(chǔ)程序?yàn)榛A(chǔ)，從退火溫度與引物濃度兩個(gè)因素來(lái)分別篩選美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的單項(xiàng)PCR反應(yīng)條件。

1.4 雙重RT-PCR方法條件篩選

綜合優(yōu)化后的美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的單項(xiàng)PCR反應(yīng)條件為基礎(chǔ)，從退火溫度與引物濃度比例兩個(gè)因素來(lái)篩選美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的雙重PCR反應(yīng)條件。

1.5 雙重RT-PCR方法的特異性與敏感性檢測(cè)

用美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV和當(dāng)前臨床比較常見(jiàn)的CSFV、PEDV及TGEV等3種RNA病毒的核酸作為模板，檢測(cè)此雙重RT-PCR方法的特異性。之后進(jìn)行雙重RT-PCR方法的敏感性檢測(cè)，將PRRSV基因片段重組質(zhì)粒模板進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)乐扌唾|(zhì)粒濃度依次為(6.6×107)～(6.6×100) copies/μL，歐洲型質(zhì)粒濃度依次為(4.0×107)～(4.0×100)copies/μL，并將循環(huán)擴(kuò)增次數(shù)增加至40次。

1.6 臨床應(yīng)用檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析

采集2020年北京、遼寧、湖南等地區(qū)5個(gè)豬場(chǎng)的200份仔豬與育成豬的血清，參考文獻(xiàn)[7]中的方法來(lái)提取病毒RNA與進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用建立的雙重RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)美洲型PRRSV與歐洲型PRRSV，并從檢測(cè)陽(yáng)性樣品中隨機(jī)選取3個(gè)來(lái)回收其RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測(cè)序鑒定。與此同時(shí)，用各自的單項(xiàng)RT-PCR方法對(duì)200份臨床樣品進(jìn)行平行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)分析用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

以美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV為模板，RT-PCR擴(kuò)增出相應(yīng)預(yù)期大小的特異性目的條帶(圖1)，分別為約650 bp、約289 bp。之后分別構(gòu)建出美洲型PRRSV與歐洲型PRRSV的基因片段重組質(zhì)粒，序列測(cè)定后的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示與各自相應(yīng)的參考基因片段序列的同源性完全一致，表明兩種基因型PRRSV的基因片段重組質(zhì)粒都構(gòu)建成功。

2.2 單項(xiàng)RT-PCR方法條件優(yōu)化

不同退火溫度進(jìn)行的單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示，美洲型和歐洲型PRRSV的目的條帶分別在54～58 ℃、56～58 ℃之間較亮，故將兩者的退火溫度范圍確定為56～58 ℃。

以57 ℃為退火溫度，不同引物濃度的單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖3)顯示，美洲型與歐洲型PRRSV的目的條帶都是在10 pmol,15 pmol,20 pmol時(shí)較亮，故將兩者引物濃度范圍確定為10～20 pmol。

2.3 雙重RT-PCR方法的條件優(yōu)化

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)方法條件為基礎(chǔ)，在56～58 ℃之間采取3個(gè)退火溫度來(lái)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果(圖4)顯示在57 ℃時(shí)擴(kuò)增出的兩個(gè)目的條帶相對(duì)更亮，故將57 ℃確定為最佳退火溫度。

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)方法條件為基礎(chǔ)，取57 ℃為退火溫度來(lái)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果(圖5)顯示，在兩者引物濃度比例為15 pmol : 15 pmol時(shí)擴(kuò)增出的兩個(gè)目的條帶相對(duì)更亮，故將15 pmol : 15 pmol確定為最佳引物濃度比例。

2.4 特異性與敏感性檢測(cè)結(jié)果

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法條件來(lái)進(jìn)行特異性檢測(cè)，從圖6可清晰看出，以CSFV,PEDV及TGEV的核酸為模板時(shí)均無(wú)任何條帶，而以歐洲型PRRSV與美洲型PRRSV的核酸為模板時(shí)則有且只有1條相符合的特異性目的條帶，說(shuō)明建立的歐洲型與美洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法有良好的特異性。

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法條件來(lái)進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，并將循環(huán)擴(kuò)增次數(shù)增加為40次，結(jié)果(圖7)顯示，能夠擴(kuò)增出歐洲型與美洲型PRRSV的特異目的條帶的最低濃度分別為6.6×101,4.0×101copies/μL，故確定歐洲型與美洲型PRRSV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度分別為66,40copies/μL。

2.5 臨床檢測(cè)結(jié)果

初步臨床檢測(cè)結(jié)果顯示，美洲型和歐洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢出率都與其各自的單項(xiàng)RT-PCR檢出率完全一致，符合率都是100%。從檢測(cè)陽(yáng)性樣品中隨機(jī)選取3個(gè)來(lái)回收其RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示其核苷酸序列與預(yù)期目的片段基因的核苷酸序列的同源性都超過(guò)99%，表明此方法檢出的臨床陽(yáng)性樣品是準(zhǔn)確可靠的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不管是單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)還是雙重RT-PCR檢測(cè)，美洲型PRRSV檢出率都極顯著(P<0.01)高于歐洲型PRRSV。美洲型與歐洲型PRRSV的個(gè)體陽(yáng)性率分別為44.0%和0，美洲型PRRSV檢出率超過(guò)40%，說(shuō)明在這些臨床樣品中美洲型PRRSV感染比較普遍。

3 討 論

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的一種主要疫病，其病原PRRSV存在美洲型與歐洲型之分，兩種基因型PRRSV毒株在中國(guó)現(xiàn)階段都有相關(guān)臨床報(bào)道[10]。因此，一種實(shí)用的高敏感性的能夠快速鑒別PRRSV的美洲型與歐洲型毒株的多重RT-PCR檢測(cè)方法具有良好臨床價(jià)值。

雖然多重RT-PCR方法能夠顯著提高檢測(cè)效率，但與單項(xiàng)RT-PCR方法相比，最需要考慮的是如何將其檢測(cè)靈敏度盡可能提高至與后者接近甚至相同。國(guó)內(nèi)已有少量關(guān)于PRRSV美洲型與歐洲型毒株多重RT-PCR檢測(cè)方法的報(bào)道，施開(kāi)創(chuàng)等[7]建立的多重RT-PCR方法的最低檢測(cè)濃度1.67×103copies/μL質(zhì)粒濃度，李冰等[8]建立的多重RT-PCR方法的最低檢測(cè)濃度1.93×103copies/μL質(zhì)粒濃度。可以看出，二者的檢測(cè)靈敏度都不太高、都還有較大提升空間。本研究根據(jù)PRRSV基因組序列在ORF5基因變異較大的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)不同特異性引物來(lái)區(qū)分美洲型和歐洲型毒株，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)的PCR擴(kuò)增經(jīng)驗(yàn)，主要從退火溫度與引物濃度這兩個(gè)條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化，建立了一種PRRSV美洲型與歐洲型毒株雙重RT-PCR檢測(cè)方法。此方法對(duì)PRRSV美洲型、歐洲型毒株的檢測(cè)靈敏度分別是6.6×101、4.0×101copies/μL，達(dá)到101數(shù)量級(jí)copies/μL，不僅較國(guó)內(nèi)已有方法的103數(shù)量級(jí)copies/μL靈敏度[7, 8]提高了24～47倍，而且與各自的單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)方法一致，顯示出非常高的敏感性；初步臨床檢測(cè)顯示，兩種基因型PRRSV的雙重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與其各自的單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也完全一致，表明在用于臨床檢測(cè)時(shí)會(huì)明顯減少假陰性結(jié)果，顯示出很高的敏感性。對(duì)當(dāng)前流行相對(duì)較廣的豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒等RNA病毒，不管是單項(xiàng)RT-PCR方法，還是雙重RT-PCR方法，都不能檢出；同時(shí)，隨機(jī)測(cè)序鑒定結(jié)果也顯示臨床檢測(cè)陽(yáng)性樣品都符合此雙重RT-PCR方法的檢測(cè)結(jié)果，說(shuō)明此雙重RT-PCR檢測(cè)方法具有良好特異性、完全可用于臨床檢測(cè)。由此表明，建立了1種高特異性與高敏感性的PRRSV美洲型與歐洲型雙重RT-PCR檢測(cè)方法，能夠較國(guó)內(nèi)已有方法大幅度降低檢測(cè)結(jié)果的假陰性率。

PRRSV傳入中國(guó)已有二十多年，美洲型毒株在臨床中經(jīng)常被檢出和分離鑒定，直到2010年后才有歐洲型毒株被檢出和分離鑒定的報(bào)道，之后關(guān)于歐洲型毒株的報(bào)道逐漸增多[11-12]。施開(kāi)創(chuàng)等[7]報(bào)道用多重RT-PCR方法從廣西地區(qū)176份樣品中發(fā)現(xiàn)美洲型與歐洲型PRRSV的檢出率分別為25.57%和0%，李冰等[8]報(bào)道用多重RT-PCR方法從遼寧地區(qū)183份樣品中發(fā)現(xiàn)美洲型與歐洲型PRRSV的檢出率分別為18.03%和1.64%。本研究用建立的雙重RT-PCR方法檢測(cè)2020年全國(guó)部分地區(qū)的200份血清樣品后發(fā)現(xiàn)，美洲型PRRSV的陽(yáng)性率為44%，歐洲型PRRSV的陽(yáng)性率為0%。不同研究者報(bào)道的歐洲型與美洲型PRRSV的臨床檢出率不盡一致，這可能與臨床樣品的采集時(shí)間與地區(qū)等因素有關(guān)。綜合已有報(bào)道數(shù)據(jù)來(lái)看，美洲型PRRSV的臨床感染普遍顯著高于歐洲型PRRSV感染，部分地區(qū)的歐洲型PRRSV感染率甚至為0，提示當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)PRRS的防控重點(diǎn)仍然要著力于美洲型PRRSV。