豬lncRNA TCONS-00035174基因全長克隆及組織表達

趙延輝，邢 凱*，盛熙暉，齊曉龍，曹永春，崔德鳳，張永紅，倪和民，郭 勇，王楚端*

(1.北京農學院 動物科學技術學院，北京 102206；2.中國農業大學 動物科學技術學院，北京 100193)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA重要的組成部分，其蛋白質編碼能力很弱甚至不存在。研究表明，基因表達受到lncRNA的調控，在細胞生長及腫瘤的生成方面起著不可替代的作用[1]。隨著下一代測序(NGS)技術的應用，lncRNA對肌肉生長和脂肪沉積的調控作用陸續被發現[2-4]。XING等[5]以閹割和正常淮南公豬為試驗對象，并選取背最長肌進行轉錄組分析，結果顯示了8 946個lncRNA的表達受到閹割的影響，其中有385個lncRNA及其靶基因可能與骨骼、肌肉發育相關。ATKINSON等[6]通過比較脂肪型豬陸川豬和瘦肉型豬杜洛克豬脂肪組織的轉錄組，共檢測到503個差異表達的lncRNA，其中部分lncRNA可能參與了脂肪細胞因子的調控過程。HUANG等[7]對萊蕪豬和大白豬皮下脂肪組織的轉錄組進行了研究，檢測到54個差異表達的lncRNA，其中有6個關鍵lncRNA及其靶基因可能發揮調控脂肪沉積的作用。MIAO等[8]對金華豬和長白豬兩者之間的脂肪組織中的lncRNA進行了鑒定，共發現了119個差異表達的lncRNA，同時發現有6個lncRNA參與相關脂肪代謝途徑，包括脂肪沉積和脂肪代謝。

松遼黑豬和長白豬在肉品質方面差異明顯[9]。課題組前期利用高通量測序技術獲得松遼黑豬和長白豬背最長肌中差異表達的lncRNA TCONS-00035174基因[10]，為對其進行深入研究，本試驗對lncRNA TCONS-00035174基因進行全長克隆并進行分子特征分析和不同組織中表達量的比較，為以后松遼黑豬和長白豬肉品質差異研究提供有用信息。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

瘦肉型長白豬和肥胖型松遼黑豬各6頭，飼養管理條件相同，屠宰體質量為100 kg左右[11]。取背最長肌及心、肝、脾、肺、腎并在液氮中保存。

1.2 引 物

根據轉錄組測序得到的TCONS-00035174基因序列，使用SnapGene軟件設計引物，分別用于熒光定量PCR、RACE末端擴增，內參基因引物根據Genebank提供的豬GAPDH基因序列設計(表1)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 總RNA的提取與cDNA合成

取2種豬的不同組織樣本0.1 g于液氮研磨，使用Trizol試劑盒提取各組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA 純度。按照反轉錄試劑盒說明將提取的總RNA反轉錄為cDNA，獲得的cDNA置于-20 ℃保存備用。

1.4 LncRNATCONS-00035174中間片段克隆

根據高通量測序得到的TCONS-00035174基因序列設計簡并引物。使用2×Phanta? Max Master Mix試劑盒(Vazyme, 中國南京)進行中間片段的擴增，反應體系：上下游引物、cDNA各2 μL， ddH2O 44 μL。反應程序：95 ℃ 15 s，56～72 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35個循環。產物4 ℃保存，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用DNA膠回收試劑盒純化PCR擴增產物。純化產物送到上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.5 LncRNA TCONS-00035174基因cDNA末端片段克隆

根據測序得到的中間序列設計5′ RACE引物(5′ GSP)和3′ RACE引物(3’GSP)(表1)擴增豬TCONS-00035174基因cDNA末端序列。按照Single Cell Full Length mRNA-Amplication Kit(Vazyme, 中國南京)說明書進行5′ RACE和3′ RACE擴增。擴增產物純化、克隆及測序同1.3。

1.6 全長序列分子特征分析

將測序結果人工進行5′和3′序列拼接, 得到最終全長序列。對豬TCONS-00035174基因進行分子特征分析，利用DNAMAN軟件進行序列基本分析；運用UCSC基因組瀏覽工具查詢TCONS-00035174在豬基因組中的定位；用NCBI中BLAST 程序進行同源性比對。利用CPC和CNCI軟件預測TCONS-00035174基因的編碼能力，CPC<0和CNCI<0被認為是非編碼基因。

1.7 LncRNA TCONS-00035174組織表達譜分析

取反轉錄出的cDNA 1 μL，使用ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix(Vazyme, 中國南京)試劑盒，進行熒光定量分析，反應體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 7.7 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH基因為內參基因，樣本和內參均設置3個平行。

試驗數據采用均數±標準差表示，采用2-ΔΔCt法[12]計算TCONS-00035174基因的相對表達量，使用SPSS軟件比較兩豬種各組織表達水平差異，兩組結果之間的比較采用t檢驗，P<0.05具有統計學意義。

2 試驗結果

2.1 LncRNA TCONS-00035174基因的全長cDNA序列

以長白豬肌肉組織反轉錄得到的cDNA為模板，采用RACE末端擴增方法和中間片段擴增方法得到TCONS-00035174基因的全長序列，其片段長3 889 bp。

2.2 分子特征分析結果

UCSC分析結果表明，TCONS-00035174基因位于chr2:5 855 637～5 859 868區間。DNAMAN軟件分析結果表明，A、C、G、T含量分別為19.3%(750個)、30.5%(1 186個)、30.6%(1 192個)、19.6%(761個)，GC含量(61.1%)明顯高于AT含量(38.9%)，說明編碼區的DNA雙鏈較為穩定。利用NCBI中BLAST 程序進行同源性比對分析，結果顯示豬TCONS-00035174基因序列與雪貂的同源性最高，為90.71%，其次為黃牛，為90.00%，與綿羊的同源性最低，為83.78%，同源性均在83%以上，說明該基因的保守性較高(表2)。

表2 豬TCONS-00035174基因與其他物種的同源性分析

經NCBI在線工具CDD對豬TCONS-00035174基因進行保守結構分析發現，在其序列中含有組織蛋白酶F(CTSF)結構域和木瓜蛋白酶結果域(圖1)。CPC和CNCI軟件預測TCONS-00035174基因的編碼能力，結果顯示CPC和CNCI的數值均為負，證明TCONS-00035174基因為非編碼基因。

2.3 LncRNA TCONS-00035174組織表達情況

利用熒光定量PCR對松遼黑豬和長白豬心、肝、脾、肺、腎和肌肉組織的TCONS-00035174基因表達情況進行研究。結果顯示TCONS-00035174基因在松遼黑豬的脾臟組織中表達最高，其次為肺和肝臟組織，心臟和肌肉中表達最低(圖2-A)；長白豬中各組織表達量最高為肺，其次為脾和肝臟組織，心臟和肌肉中表達最低(圖2-B)；在相同組織中，TCONS-00035174基因在松遼黑豬和長白豬之間的差異表達情況為：除了腎臟之外，松遼黑豬中的表達均顯著高于長白豬(圖3)。

3 結論和討論

本研究成功地克隆了豬TCONS-00035174基因的cDNA全長序列，得到長度為3 889 bp的精準序列，使用NCBI數據庫對序列進行BLAST比對，結果發現，該段序雪貂的同源性最高，與其他物種同源性均在83%以上，說明該基因的保守性較高。

TCONS-00035174基因列中含有組織蛋白酶F結構域，推測CTSF基因可能是TCONS-00035174基因的相關靶基因，通過該靶基因來調控肌肉發育。組織蛋白酶 F屬于半胱氨酸蛋白酶[12,13]，是組織蛋白酶(Cathepsins，CTS)家族的一員。CTS是一類酸性蛋白質水解酶，可以將蛋白質裂解為多肽(通過裂解蛋白質肽鍵)。通常情況下，CTS主要在水解及修飾細胞內蛋白質的過程中發揮作用，同時維護保持蛋白質的平衡狀態。研究表明，CTS在肉的嫩化方面發揮重要作用[14]。本研究推測CTSF可能是TCONS-00035174基因的相關靶基因，且二者基因序列存在堿基互補配對關系，認為TCONS-00035174可能是CTSF的反義lncRNA或者存在其他某種調控關系，TCONS-00035174基因調控CTSF的表達來調節蛋白質的代謝，從而影響肌肉發育過程。

本研究采用熒光定量PCR法研究了TCONS-00035174基因在不同組織表達模式，研究發現在心、肝、脾、肺、腎以及肌肉中均有表達。結果TCONS-00035174基因在松遼黑豬和長白豬中表達最高的組織不同，分別是脾和肺，但是表達最低的組織是相同的，均是心臟和肌肉組織。在前面試驗中，推測TCONS-00035174可能作為CTSF的反義lncRNA來調控蛋白質代謝，從而影響肌肉發育。

綜上所述，豬TCONS-00035174基因全長為3 889 bp，位于chr2:5 855 637～5 859 868區間，沒有編碼潛能；與雪貂的同源性最高；在松遼黑豬的脾臟組織中表達最高，在長白豬中肺臟組織中表達最高，相同組織中，除腎臟外，松遼黑豬各組織的表達量均顯著高于長白豬。研究結果為后期該基因的深入挖掘和功能研究提供幫助，為后續遺傳育種工作提供有價值參考。