病毒誘導基因沉默對葉用萵苣內源激素含量的影響

許夢男，郝新迪，陳 麗，韓瑩琰

(農業應用新技術北京市重點實驗室/植物生產國家級實驗教學示范中心/北京農學院 植物科學技術學院，北京 102206)

葉用萵苣屬菊科萵苣屬，原產于歐洲地中海沿岸，為1～2年生的草本植物，口感清脆，食用方便，富含鐵和鎂等許多礦物質，并含有鉀、鈣、磷、硫等人體必需元素，營養保健價值高，受到廣大消費者的青睞。葉用萵苣屬于一類重要的葉類蔬菜，近年來也成為菊科植物基因組計劃中被廣泛研究的重要物種。

內源激素對植物有重要作用，是植物在特定環境信號誘導下通過自身代謝產生的小分子有機化合物。植物的一生都在受激素的調節，從種子萌發到開花結果再到衰老凋謝[1]。這些簡單的小分子物質相互作用，產生復雜的生理生化效應，對植物的生長發育產生重要影響。生長素和赤霉素主要功能是促使細胞分裂分化，促進莖的伸長，有研究發現在水稻、擬南芥受到病原物侵染時，這兩種激素可以起防御作用[2]。脫落酸又稱應激激素，它可以使植物在受到外界不良刺激時誘導植物體內產生相關酶，提高自身抗性[3]。茉莉酸可以提高植物的防御能力，茉莉酸途徑中COI1基因編碼的F-box蛋白在植物防御反應中具有重要功能[4]。幾種激素在植物體內可以單獨行使功能，各激素的信號途徑又可以相互交叉，形成一個復雜的調控網絡，在植物體內發揮重要效應，使植物在受到一定的生物和非生物脅迫時，能夠提高自身防御性和恢復能力。

病毒誘導的基因沉默技術，周期短，方法操作簡單，該技術是用病毒攜帶目的基因侵染植物，使其表型和生理上出現變化，從而研究該基因在植物中行使的功能[5]。最早被用來描述植物受病毒侵染后癥狀的恢復情況，現已有效運用于鑒定植物對脅迫做出的應答反應[6,7]。植物在受到病毒侵染后會將病毒的mRNA降解掉，出現一定程度的抗性，形成一種保護自身穩定的機制，現在廣泛應用的是TRV病毒載體，成功的應用于辣椒、馬鈴薯、煙草等植物上[8,9]。

ZFP鋅指蛋白是一種具有指狀結構并且需要與Zn2+結合的轉錄因子，在植物中被廣泛研究，該蛋白主要參與植物的形態建成、生長發育，抵抗非生物脅迫及激素響應，除此之外，ZFP鋅指蛋白在植物受到生物脅迫后也會做出防御反應，對促進植物的生命進程有重要影響[10,11]，本試驗利用VIGS技術侵染葉用萵苣，誘導LsZFP1沉默后，測定葉用萵苣內源激素含量，分析經TRV介導侵染后，各處理葉用萵苣內源激素含量有何變化，為進一步探究LsZFP1在葉用萵苣中行使的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

葉用萵苣品種‘PS-11’由北京開心格林科技有限公司提供，種植于北京農學院計算機溫室。選取干凈無雜質的種子進行催芽處理，播種于50孔穴盤，幼苗長至4葉1心時，單棵定植在營養缽中，緩苗7 d后，進行TRV病毒侵染。試驗處理為：攜帶LsZFP1基因的病毒載體(TRV-LsZFP1)，空載(TRV)，空白對照(WT)。

1.2 方 法

1.2.1 侵染葉用萵苣 將配置好的侵染液用不帶針頭的注射器注入葉片背面，直至有明顯水漬狀，每個處理注射30株，每株注射2片葉子，每片葉子以葉脈為中心注射兩處。注射21 d后，取其功能葉片和莖，速凍于液氮后，-80 ℃保存，每個處理3次重復。

1.2.2 鑒定侵染植株 用TRV特異性引物(TRV-F：5′-GCTTTATTATTACGGACGAGTGG-3′； TRV-R：5′-GAACCTAAAACTTCAGACACGGAT-3′)檢測處理植株。

1.2.3 內源激素測定 酶聯免疫法測定四種激素含量，選用ELISA試劑盒。稱0.7 g樣品于研缽中，研缽提前冰浴，后續研磨也一直處于冰浴狀態，加入2 mL 提取液將樣品磨碎，轉入離心管中，再用提取液沖洗研缽一并轉入管中，4 ℃下提取6 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液并記錄體積。上清液過固相萃取柱后轉入離心管中，吹干，用樣品稀釋液定容至2 mL，490 nm波長，上酶聯免疫儀(BIO-RAD Mode 550)讀數[12]。

采用Excel 2019處理數據，使用SPSS軟件進行顯著性分析，用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 檢測鑒定結果

如圖1所示，TRV出現200 bp左右的條帶，侵染植株TRV-LsZFP1出現400 bp左右條帶，空白處理無條帶，結果表明，TRV病毒成功侵染到植株中。

2.2 侵染后葉用萵苣脫落酸含量變化

脫落酸作為應激激素，在植物受到不良刺激后含量會迅速上升，提高自身抗性。圖2可以看出，TRV-LsZFP1侵染植株莖、葉中脫落酸含量都很高，均到400 μg/L以上；空白處理的植株中，莖、葉脫落酸含量是TRV-LsZFP1侵染植株的65%，顯著降低，可以看出脫落酸含量受LsZFP1基因表達的影響。TRV侵染植株中脫落酸含量在320 μg/L左右，2個處理脫落酸含量都顯著高于空白對照。

2.3 侵染后葉用萵苣生長素含量變化

圖2可以看出，TRV-LsZFP1和TRV侵染的植株莖、葉中生長素含量高，均達到100 μg/L左右，空白處理的植株中，莖、葉生長素含量是75 μg/L左右，和侵染植株相比顯著降低40%左右。

2.4 侵染后葉用萵苣茉莉酸含量變化

茉莉酸主要參與植物的生長發育和免疫反應，可以從多方面增強植物對細菌、病毒的抗性。圖2可以看出，每個處理葉中茉莉酸含量要高于莖中茉莉酸含量。TRV-LsZFP1侵染植株葉中茉莉酸含量顯著高于空白對照，其含量為1 311.92 μg/L，與TRV處理相比提高18%，相比空白對照提高38%。TRV-LsZFP1侵染植株和TRV莖中茉莉酸含量達到1 200 μg/L左右，顯著高于對照組32%。

2.5 侵染后葉用萵苣赤霉素含量變化

赤霉素會促進植物莖的伸長，當赤霉素合成受到抑制時，葉用萵苣莖伸長時間(抽薹)會延后，有利于對葉用萵苣抗抽薹方面的研究。圖2可以看出，TRV-LsZFP1侵染植株與其他兩個處理差異是顯著的?？傮w來看，TRV-LsZFP1侵染的植株中赤霉素含量最低，莖中赤霉素含量為498.26μg/L，葉中含量為460.39 μg/L；TRV侵染的植株和空白對照莖、葉中赤霉素含量相近，為590 μg/L左右， TRV-LsZFP1侵染植株與兩者相比，下降了21.6%。

3 討 論

植物在受到生物和非生物脅迫時，為了維持自身正常的生理機能，會啟動自身防御網絡，該網絡是由復雜的信號轉導途徑組成的一套防御系統，植物體內各種激素相互作用形成的生理效應就是此防御系統的重要組成部分[13,14]。許多研究表明，茉莉酸、脫落酸在植物受到病原體侵染過程中會發揮重要功能，積極防御病原體對植物產生的不良反應[15]。茉莉酸主要是通過調節茉莉酸途徑中的轉錄因子，受體復合物和相關茉莉酸合成基因組成的信號轉導網絡來抵抗病原體對植物體造成的危害[16]。植物受侵染出現傷口后，細胞膜會發生電位變化，加速茉莉酸的合成[17]。脫落酸參與植物脅迫反應，通過誘導與抗性有關酶的合成而提高植物在不良環境中的適應能力。脫落酸也會促進茉莉酸信號路徑的分支反應，當死體營養性病原物侵染擬南芥時，茉莉酸受脫落酸影響，在擬南芥中的含量水平會升高，使擬南芥增強對病原體的抗性[18]。本試驗中，將TRV病毒載體注射侵染葉用萵苣后，侵染植株脫落酸和茉莉酸含量較對照植株會顯著升高，表明葉用萵苣受到病毒注射傷害后，為了抵抗脅迫，會做出應激反應，調控內源激素含量發生變化，來增加自身抗性。ZFP鋅指蛋白也是植物抵抗脅迫過程中的重要組成部分[19]，本試驗中，LsZFP1轉入TRV病毒載體后侵染葉用萵苣，TRV-LsZFP1植株赤霉素顯著低于其他兩組對照，而TRV處理組與空白對照組無明顯差異，赤霉素含量下降可能是由于TRV-LsZFP1經農桿轉導侵染葉用萵苣后，LsZFP1表達受到抑制，而在某種通路中促進DELLA蛋白合成，使赤霉素信號轉導受到阻礙導致含量降低。另外一種可能是葉用萵苣受到病毒侵染后，與赤霉素合成相關的反饋調節的敏感性降低，具體機制還需進一步研究[3]。當赤霉素途徑受到抑制時，赤霉素合成含量降低，有另外一點優勢是可以延長葉用萵苣莖伸長的時間，這有助于對葉用萵苣抽薹作用的研究。生長素也能有效參與植物抵抗脅迫的過程，在本試驗中，TRV-LsZFP1和TRV侵染植株生長素含量較空白對照植株顯著增加，我們推測當葉用萵苣受到TRV病毒侵染后，影響生長素合成的相關通路，使生長素含量在植物受到病毒侵染后顯著增加，促進侵染傷口盡快恢復[20]。植物體內各種激素信號轉導途徑，組成了植物防御反應的復雜調控網絡，具體作用機制有待進一步研究。