基于轉錄組信息的葉用萵苣MADS-box轉錄因子家族分析

郝新迪，許夢男，董波波，陳 麗，劉超杰，范雙喜，韓瑩琰

(北京農學院 植物科學技術學院/農業應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206)

葉用萵苣(LactucasativaL.)，俗稱生菜，是北京地區種植面積最大的葉類蔬菜，其性喜冷涼氣候，夏季高溫造成“先期抽薹”，嚴重影響食用品質和商品價值[1,2]。抽薹開花是植物從營養生長向生殖生長轉變的關鍵環節，稱為成花轉變。植物成花轉變時間受到復雜的遺傳調控網絡的嚴格控制，到目前為止，在模式植物擬南芥中，已經確定了春化途徑、自主途徑、環境溫度途徑、赤霉素途徑、光周期途徑、年齡途徑和糖途徑等7條控制開花的遺傳途徑[3,4]，這7條途徑彼此獨立又相互交織，它們激活了一套開花途徑整合子基因[包括MADS-box家族基因SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS(SOC1)和AGAMOUS-LIKE24(AGL24)]，進而激活花分生組織特征基因[包含MADS-box家族基因APETALA1(AP1)，CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)]，最終啟動擬南芥開花[4-6]。在擬南芥光誘導開花途徑中，CONSTANS(CO)在擬南芥韌皮部伴細胞中表達并激活FT在葉片維管組織中表達，隨后FT轉運至頂端分生組織中激活FUL和SOC1在莖頂端分生組織中表達，從而開啟花發育[7,8]。此外，春化途徑通過抑制MADS-box基因FLOWERINGLOCUSC(FLC)表達來激活開花[3]。與擬南芥、大白菜、甘藍、蘿卜等“低溫春化”型蔬菜不同，葉用萵苣從種子發芽到花芽分化前的高溫環境關系到其花芽形成從而影響抽薹，氣溫越高抽薹越早[9]。前期研究發現赤霉素調節葉用萵苣的抽薹，但也許是MADS-box基因，而不是赤霉素，在表現不同抽薹效果中起到重要作用[10]。

目前，關于葉用萵苣MADS-box基因的研究鮮有報道。前期課題組研究過程中在葉用萵苣基因組中共鑒定了82個MADS-box家族基因[11]，后續利用2個具有高溫抽薹性差異的品種：耐抽薹品種‘S24’和易抽薹品種‘S39’進行轉錄組分析，發現9個促進開花的MADS-box家族基因被特異性誘導[10]。對高溫和常溫下生長的品種‘S39’進行轉錄組學分析，發現5個MADS-box基因差異表達[12]。

本研究對葉用萵苣中上述14個MADS-box家族轉錄因子進行鑒定分析，以葉用萵苣品種‘S39’為試驗材料，采用qRT-PCR技術檢測在高溫處理下14個MADS-box家族基因的表達模式，篩選在葉用萵苣高溫抽薹過程中發揮重要作用的MADS-box家族基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以葉用萵苣早抽薹品種‘S39’為試驗材料。將種子催芽24 h 后播種于50孔穴盤(草炭∶珍珠巖∶蛭石=3∶2∶1)中，在人工氣候室中生長，1周后定植于直徑10 cm營養缽中：白天25 ℃，夜晚15 ℃，光照強度12000 lx，光照時間16 h/d，相對濕度為60%；，植株生長至5葉1心時進行高溫處理：白天35 ℃，夜晚25 ℃，其余條件不變。高溫處理1 d，3 d，5 d，7 d，9 d，11 d，13 d，15 d后分別隨機選取3株長勢一致的幼苗，取其第4片真葉，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉用萵苣MADS-box家族轉錄因子的篩選和理化性質分析 基于實驗室已有的轉錄組測序數據[10,11]，篩選到14個差異表達的MADS-box家族轉錄因子，利用DNAMAN將14個MADS-box轉錄因子序列比對到此前課題組鑒定的82個MADS-box轉錄因子序列中[9]，采用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具預測葉用萵苣MADS-box蛋白理化性質，采用在線網站 Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)預測亞細胞定位。

1.2.2 樣品總RNA提取和反轉錄 葉用萵苣總RNA提取參照快速通用植物RNA提取試劑盒(北京興華越洋生物科技有限公司)說明書。利用Thermo NanoDrop2000紫外分光光度計檢測 RNA樣品濃度；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 質量。總RNA反轉錄參照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)說明書。

1.2.3 qRT-PCR 以高溫處理1 d，3 d，5 d，7 d，9 d，11 d，13 d，15 d后葉用萵苣‘S39’葉片cDNA為模板，利用Primer 5.0 設計引物(表1)，以葉用萵苣18SribosomalRNA(HMO047292.1)為內參基因(表1)。使用 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(北京寶日醫生物技術有限公司)進行qRT-PCR反應。反應體系10 μL，包括5 μL TB Green?Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)，2 μL ddH2O，1 μL cDNA模板，上、下游引物各1 μL。反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共39個循環。反應在Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀上進行。每個樣本設置3次重復。采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primers for sequences

2 結果與分析

2.1 相關MADS-box基因的篩選和理化性質分析

根據實驗室前期轉錄組數據分析，對MADS-box相關基因功能和亞細胞定位進行預測，發現9個MADS-box基因在‘S24’和‘S39’中差異表達(表2)，5個MADS-box基因在常溫和高溫處理下的‘S39’中差異表達(表3)。

表2 ‘S39’中9個上調的MADS-box基因[10]Tab.2 List of 9 MADS-box genes that were significantly up-regulated in lettuce line ‘S39’

表3 高溫下‘S39’莖尖中5個上調的MADS-box基因[12]

利用ExPASy protparam tool對14個葉用萵苣MADS-box蛋白進行理化性質分析，由表4可知，14個MADS-box編碼蛋白的氨基酸數量為212(LsMADS39和LsMADS45)～253(LsMADS14)個，理論等電點范圍為5.27(LsMADS39)～9.44(LsMADS32)，表明不同的MADS-box家族蛋白質在不同的微環境中發揮的功能存在差異。除LsMADS16和LsMADS39為穩定蛋白外，其余均屬于不穩定蛋白(不穩定系數小于40為穩定蛋白)。14個MAD-box蛋白的脂肪系數為71.36(LsMADS48)～92.88(LsMADS39)，均小于100，平均親水性均小于0，為親水性蛋白。通過在線軟件Cell-PLoc 2.0對14個MADS-box基因家族成員的氨基酸序列進行亞細胞定位預測，結果顯示14個MADS-box家族蛋白均定位于細胞核內。

表4 14個葉用萵苣MADS-box基因理化性質分析Tab.4 Analysis of physicochemical properties of 14 MADS-box genesin lettuce

2.2 對MADS-box相關基因進行qRT-PCR分析

在葉用萵苣‘S39’中不同時間高溫處理下，MADS-box相關基因表達量如圖1所示，LsMADS32表達量無顯著規律；LsMADS16和LsMADS37表達總體呈下降趨勢；LsMADS5，LsMADS14，LsMADS15，LsMADS29，LsMADS35，LsMADS39，LsMADS43，LsMADS45，LsMADS48，LsMADS54和LsMADS56表達趨勢基本相同，呈先上升后下降趨勢，LsMADS15在高溫處理7 d后達到峰值，其他基因在高溫處理5 d后達到峰值，其中LsMADS54在高溫處理5 d后驟升1 000倍，LsMADS56在高溫處理5 d后驟升70倍。

3 討 論

MADS-box是一類重要的轉錄因子，在植物根[13]和葉片[14]發育、果實發育[15]和成熟[16,17]、開花和花發育[11]等生長發育過程和逆境脅迫[18]中發揮著重要作用。前期課題組研究發現，在易抽薹品種‘S39’中9個MADS-box相關基因能夠明顯的誘導開花，這表明MADS-box基因在表現不同抽薹效果中可能起到重要作用[10]。

本研究通過對葉用萵苣轉錄組數據進行挖掘，共鑒定出14個與高溫促進抽薹相關的MADS-box家族轉錄因子。理化性質研究結果表明，不同MADS-box蛋白的理化性質存在一定差異，說明其發揮的生物學功能也不相同。亞細胞定位預測結果顯示14個MADS-box蛋白均定位于細胞核，這符合其作為轉錄因子的特征，可能通過調控細胞核基因的轉錄來發揮其功能[19]。

本研究通過對14個葉用萵苣中MADS-box相關基因在高溫處理下的表達量分析得出：LsMADS32表達量無顯著規律，推測其與葉用萵苣高溫抽薹無關；LsMADS16和LsMADS37表達總體呈下降趨勢，推測其對葉用萵苣高溫抽薹具有負調控作用；LsMADS5，LsMADS14，LsMADS15，LsMADS29，LsMADS35，LsMADS39，LsMADS43，LsMADS45，LsMADS48，LsMADS54和LsMADS56表達呈先上升后下降趨勢，LsMADS15在高溫處理7 d后達到峰值，其他基因在高溫處理5 d后達到峰值，其響應高溫脅迫的表達模式與‘S39’在高溫處理后7 d左右頂端分生組織呈拱形狀，隨后發生從營養生長向生殖生長轉變的細胞學觀察結果一致[12,20]。LsMADS54在高溫處理5 d后驟升1 000倍，LsMADS56在高溫處理5 d后驟升70倍，推測其為葉用萵苣響應高溫誘導后抽薹開花調控網絡中的關鍵基因。

綜上所述，本研究分析了高溫處理下14個葉用萵苣高溫促進抽薹的相關MADS-box基因的表達模式，發現LsMADS54和LsMADS56可能在葉用萵苣響應高溫誘導后抽薹開花中起關鍵作用，但其作用機制還有待進一步研究。