非洲豬瘟病毒UBCv1的原核表達及多抗制備

蔣思文，房立春，馮澤新，焦 鵬，王玥超，梁 艷，史東宇，陳 青*

(1.北京農學院 生物與資源環境學院/ 農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京102206；2.山東省農業科學院，濟南250100)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfarviridae)的大型包膜病毒，也是唯一已知的蟲媒DNA病毒，主要在胞質中完成復制和組裝[1,2]。ASFV病毒粒子具有雙層囊膜結構，呈二十面體形態，平均直徑200 nm，不同分離株的雙鏈DNA長度范圍在170 ～ 193 kbp之間[3, 4]，編碼150～200種蛋白質，其中包括負責調節病毒和宿主細胞功能的相關蛋白[5, 6]。

ASFV的I215L基因編碼一個與泛素結合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC，E2)高度同源的基因序列，且在大腸桿菌中表達時具有UBC活性。它在純化的泛素激活酶(E1)和ATP存在下與泛素分子形成硫醚鍵，隨后將泛素轉移到特定的蛋白質底物上[7]。這是迄今為止報道的唯一一個由病毒基因編碼的具有功能活性UBC酶，故將ASFV的I215L基因產物稱為泛素結合酶(UBCv1)[7-9]。重組UBCv1在體外可以自泛素化，也可以泛素化組蛋白以及ASFV病毒粒子核殼多蛋白pp62[10]。最新研究發現了病毒UBCv1與宿主發生互作的蛋白，Barrado推測UBCv1通過影響mTORC信號通路、調節宿主翻譯機制及ASFV生命周期中細胞蛋白的表達發揮作用，但具體機制仍不清楚[9]。本文作者將ASFV的I215L基因克隆至原核表達載體中構建UBCv1重組質粒，低溫誘導表達、親和標簽純化該蛋白，并在此基礎上制備多克隆抗體，為非洲豬瘟病毒UBCv1蛋白生物學功能的深入研究提供材料，并為ASFV致病機理研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pET-28a載體、p3XFLAG-CMV-7.1-I215L載體由北京畜牧獸醫研究所獸醫公共衛生創新與管理團隊提供；大腸桿菌DH5α感受態細胞和BL21(DE3)感受態細胞均購自TIANGEN公司；6～8周齡的BALB/c小鼠購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物實驗均通過北京農學院實驗動物福利與倫理審查(BUA2021028)。BamH I、HindIII限制性內切酶、DNA Ligation Kit、2×PrimeSTAR? Max DNA Polymerase均購于TaKaRa生物公司；IPTG、His-tag抗體(小鼠單抗)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、SDS-PAGE Gel Kit和超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；TIANgel Midi Purification Kit、DAB顯色試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 I215L基因的擴增與重組質粒的構建

以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L質粒為模板(其中I215L基因根據ASFV Georgia 2007/1株I215L序列(Gene ID:FR682468.1)合成)，以序列5′CGCGGATCCATGGTTTCCAGGTTTTTAATAG 3′(下劃線處為BamH I 酶切位點)和序列5′CCCAAGCTTTTACTCATCATCCTCCTCCTCTTC 3′(下劃線處為HindIII酶切位點)為引物進行PCR擴增。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，將含有I215L片段的膠塊，用試劑盒回收，回收產物用BamH I和HindIII雙酶切，酶切產物經純化回收；pET-28a做同樣處理后，將二者連接。連接產物轉化于E.coliDH5α，用含卡那霉素平板過夜培養進行篩選，挑取單菌落擴增培養后提取質粒，PCR及雙酶切鑒定后由公司測序，驗證序列的正確性。

1.3 誘導表達重組蛋白

用構建好的pET-28a-I215L質粒和pET-28a對照分別轉化E.coliBL21(DE3)，用含卡那霉素的平板過夜培養進行篩選，挑取單菌落于液體LB振蕩培養后，再以1∶100的體積比將活化的菌液擴大培養，將600 nm光下吸光度為0.6～0.8的菌液，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃條件下分別誘導10 h、21 h、24 h，離心收集菌體，PBS重懸菌體后超聲破碎至澄清，分別收集全菌液、沉淀、上清進行SDS-PAGE電泳，對其表達情況與可溶性進行分析。

16 ℃下IPTG誘導24 h的重組菌和陰性對照菌破碎上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉印至PVDF膜，封閉液4 ℃封閉過夜，加入抗His標簽的小鼠單抗(1∶1 000)稀釋液作為一抗，4 ℃孵育2 h；洗滌后，用HRP標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)稀釋液作為二抗，4 ℃孵育2 h；洗滌后，加DAB底物進行顯色，對重組蛋白進行Western blot鑒定。

1.4 表達蛋白的純化與鑒定

大量表達蛋白質后，參照BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin試劑盒說明書純化蛋白，離心收集菌體，用無菌的PBS洗滌2遍后，用裂解液重懸菌體，加入溶菌酶至終質量濃度1 mg/mL，冰上放置30 min，超聲破碎后離心收集上清液，將上清加入預先處理好的Ni-NTA填料于4 ℃結合2 h，用1倍柱體積含5 mmol/L咪唑的洗滌液洗滌雜蛋白，洗柱5次，再用含有300 mmol/L的咪唑的Tris緩沖溶液(pH = 8.0)洗脫，收集洗脫液。純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜，封閉液4 ℃封閉過夜，加入抗His標簽的小鼠單抗(1∶1 000)稀釋液為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)稀釋液為二抗，對純化重組蛋白進行Western blot分析。

1.5 多克隆抗體的制備

將50 μg純化重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻后，在BALB/c小鼠背部皮下多點注射進行首免，同時對照組接種等量體積的PBS。首免后14 d、28 d和42 d，分別將50 μg純化重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻后進行加強免疫。四免后7 d小鼠眼眶取血，收集血清。

1.6 多克隆抗體效價的測定

采用方陣滴定法，將純化的UBCv1稀釋為質量濃度3 μg/mL包被酶標板，每孔加入100 μL，4 ℃包被過夜；洗滌液洗滌后以含1% BSA的封閉液37 ℃封閉2 h；再用洗滌液洗滌。將不同稀釋度的多抗(1∶90 000、1∶270 000、1∶810 000、1∶2 430 000、1∶7 290 000、1∶21 870 000、1∶65 610 000)和陰性血清稀釋液作為一抗，每孔加入100 μL，37 ℃保溫1 h；洗滌液洗滌。二抗為稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，每孔加入100 μL，37 ℃保溫1 h；洗滌液洗滌。每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光反應15 min后加入100 μL終止液(2 mol/L硫酸)終止反應。用酶標儀測定450 nm處吸光值，記錄并分析。

1.7 多克隆抗體的Western Blot鑒定

將純化的重組蛋白和陰性對照在同一凝膠上進行SDS-PAGE電泳后，采用濕轉法轉印到PVDF膜上，經過洗滌、封閉后，采用本文制備的多克隆抗體稀釋液(1∶1 000)作為一抗，37 ℃孵育1 h；洗滌后，用HRP標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)稀釋液作為二抗，37 ℃孵育2 h；洗滌后，加DAB底物進行顯色，拍照記錄并分析結果。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建與鑒定

對重組質粒pET-28a-I215L進行PCR鑒定，得到639 bp的條帶(圖1)，與預期片段大小一致；經HindIII和BamH I雙酶切，得到兩條條帶，大小約為5 500 bp和650 bp，條帶大小分別與載體5 369 bp及目的基因639 bp大小一致(圖1)。對陽性質粒進行測序，測得序列經BLAST分析，與ASFV Georgia 2007/1參考毒株的I215L序列一致。

2.2 UBCv1的誘導表達及可溶性分析

SDS-PAGE結果表明，IPTG終濃度1 mmol/L時，16 ℃誘導0 h、10 h、21 h、24 h后，在預測的28 kDa位置，出現一條逐漸加深的條帶，與預期大小相符(圖2)，并經Western blot驗證，28 kDa位置處出現特異性條帶(圖2)，表明UBCv1獲得了正確表達。通過菌體裂解液上清、沉淀條帶結果可知，UBCv1以可溶性表達為主(圖2)。

2.3 UBCv1的純化及鑒定

利用帶His標簽的填料來純化重組UBCv1，純化后進行SDS-PAGE、Western blot鑒定，由圖3可知，純化后出現特異的條帶，約28 kDa，與預期目的條帶大小一致。

2.4 重組蛋白多克隆抗體效價的檢測

以純化的UBCv1為包被抗原，倍比稀釋后包被酶標板，采用間接ELISA 法測定UBCv1的鼠源多克隆抗體效價。以陽性孔OD值(P)與陰性孔OD值(N)的比值大于2.1的最高稀釋度為多抗效價。結果表明，純化后的多抗效價為1∶7 290 000。以制備的多克隆抗體作為一抗，進行Western blot檢測，28 kDa處出現明顯條帶(圖4)，說明多克隆抗體能夠特異性識別ASFV的UBCv1。

3 討 論

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)所致的一種烈性病毒性的豬傳染病，它主要具有高急性、高熱、高毒和高病死率等臨床癥狀和傳染特點，目前已經擴散到非洲、亞洲和歐洲的許多國家和地區[11]。盡管近些年來，對ASFV的致病機制、入侵機制、病原與宿主互作和免疫逃逸機制等方面的研究有了很大的進展，但仍存在許多未知領域亟待深入研究。

泛素化是一種蛋白質翻譯后修飾，可以介導蛋白質通過泛素-蛋白酶體途徑進行選擇性降解，進而廣泛地調控細胞的轉錄、信號轉導、細胞周期調控等過程[12, 13]。泛素結合酶(E2)又稱為泛素載體蛋白，可將激活的泛素分子從泛素活化酶(E1)轉移至E2。與E2結合的泛素分子進一步被轉移至泛素連接酶(E3)所識別的特異底物蛋白質上[14]。在病毒感染過程中，很多病毒利用泛素化修飾啟動免疫逃逸，如皰疹病毒、痘病毒等大型DNA病毒可借助其編碼的E3泛素連接酶或去泛素化酶逃避宿主的先天免疫系統，促進病毒的復制傳播[15, 16]。

UBCv1是ASFV一種非常早期的病毒蛋白，其表達不依賴于病毒DNA復制，感染早期定位于細胞核之中，感染晚期在細胞核及細胞質中均有表達，這表明UBCv1隨著ASFV感染進程可以在細胞核和細胞質之間動態穿梭[9]。UBCv1在ASFV感染中發揮了關鍵作用，通過劫持細胞泛素-蛋白酶體系統，調節宿主蛋白及其自身蛋白的功能和亞細胞定位。ASFV很可能利用UBCv1干擾泛素機制，從而調節多種病毒機制(如轉錄、復制和衣殼化)和細胞功能(如抗病毒應答、DNA損傷應答、凋亡)[17]。

UBCv1是目前已知的唯一病毒泛素結合酶(E2)，因此該蛋白科學價值很高[10]。早期，有人報道了UBCv1影響細胞核蛋白SMCy的活性，但意義未知[18]；最近又有人報道了UBCv1與宿主細胞的40S核糖體蛋白RPS23，翻譯起始因子eIF4和細胞連接酶Culin 4B有相互作用，推測UBCv1會影響mTORC信號通路、宿主翻譯機制等細胞過程，但具體機制仍不清楚[9]。

本文作者利用原核表達系統表達非洲豬瘟病毒泛素結合酶(UBCv1)，針對ASFV的I215L基因，采用了含有His標簽的pET-28a原核生物表達載體，構建了UBCv1的重組質粒，低溫誘導BL21(DE3)表達UBCv1的重組蛋白，可溶性表達，經過His標簽純化柱純化后，免疫小鼠制備多克隆抗體，ELISA檢測多抗效價，效價較高，可為非洲豬瘟病毒UBCv1蛋白生物學功能及病毒相關致病機制的深入研究提供重要的生物材料。